疫苗前沿 | 一款四价mRNA猴痘疫苗的设计与体内外验证

猴痘是由猴痘病毒（Monkeypox virus，MPXV）引起的人畜共患病毒性疾病，已被世界卫生组织（WHO）宣布为公共卫生紧急事件。针对迅速蔓延的猴痘流行，急需高效且安全的MPXV疫苗。2023年4月，军事医学科学院王升启团队的研究人员在Signal Transduction and Targeted Therapy上发表题为

Monkeypox virus quadrivalent mRNA vaccine induces immune response and protects against vaccinia virus》

发表期刊: Signal Transduction and Targeted Therapy

发表时间: 2023年4月

影响因子: 40.8

应用技术: NxGen微流控技术、透射电镜、转录组、慢病毒转染、免疫印迹、、Quant-it RiboGreen RNA定量、流式细胞术、ELISA、ELISPOT、生物发光成像（BLI）、H&E染色等。

01

猴痘病毒概述

正痘病毒（Orthopoxvirus）是一类双链DNA病毒，包括天花病毒（Variola Virus，VARV）、VACV、MPXV和牛痘病毒（Cowpox virus，CPXV），可产生2种抗原组成不同的具有感染性的病毒粒子，一种是细胞内成熟病毒粒子（Intracellular mature virus，IMV），如M1R、E8L、A29L等。另一种是细胞外包膜病毒粒子（Extracellular enveloped virus，EEV），EEV在IMV的基础上多了一层来自内质网的包膜，这层包膜上面嵌入了特异性的蛋白，如A35R、B6R等。本研究选择猴痘病毒的同源基因（非痘苗病毒），靶向MPXV的四种抗原：A29L和M1R（IMV特异性蛋白），A35R和B6R（EEV特异性蛋白），开发了两种猴痘四价mRNA疫苗mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP，两种疫苗能够诱导小鼠产生特异性IgG抗体和抗VACV中和抗体，免疫小鼠产生了持久的细胞免疫反应，且疫苗能够保护小鼠免受VAVC攻击。

02

mRNA-LNP的制备与表征

该项研究中，研究人员选择A29L、A35R、M1R和B6R作为mRNA编码序列的抗原靶点，开发了针对IMV和EEV的MPXV四价mRNA疫苗，修饰后的mRNA分子包含5’ Cap、5’ UTR、编码抗原的开放阅读框、3’ UTR和Poly-A尾（图1a）。基于不同的mRNA设计平台，研究人员构建了两组mRNA疫苗：mRNA-A-mix和mRNA-B-mix。Western blot分析发现，mRNA-mix在对应四种抗原蛋白的位置上均检测到条带，表明mRNA-A-mix和mRNA-B-mix成功表达蛋白（图1b）。

LNP制备过程中，作者首先将阳离子脂质、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）、胆固醇和DMG-PEG2000按摩尔比50：10：38.5：1.5溶解在乙醇中，再使用基于NxGen微流体技术的Nano Assemblr Ignite™系统，将脂质混合物与含有mRNA的20 mM柠檬酸缓冲液（pH 4.0）以1:3的体积比混合，以实现mRNA的包封。最后使用100K MWCO蛋白浓缩管 (PES) 浓缩至所需浓度，得到两种四价mRNA-LNP分别命名为mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP（图1c）。使用LitesizerTM 500通过动态光散射技术测量两种mRNA-LNP的平均粒径分别为98.16 nm和89.11 nm；使用Quant-iT RiboGreen RNA Kit检测mRNA-LNP的包封效率，包封率均超过90%（图1d）。透射电子显微镜（TEM）分析显示，mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP颗粒呈均匀的实心球形形态，表明两种四价mRNA的LNP形态保持稳定（图1e）。综上，mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP能有效在体外表达MPXV的A29L、A35R、M1R和B6R蛋白，包封率高且形态稳定。

图1 mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP的设计与包封

03

mRNA猴痘疫苗

在小鼠中诱导强效的体液免疫

本研究评估了mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP在小鼠中的免疫原性和有效性（图2a）。小鼠两次接种mRNA-A-LNP或mRNA-B-LNP，间隔14天，未接种小鼠作为对照组，首次接种后第10天和24天收集小鼠血清（图2a）。ELISA评估针对MPXV四种抗原的结合抗体反应，所有接种疫苗的小鼠均检测到针对四种靶抗原的抗体，并且随着免疫次数的增加，抗体水平显著上升（图2b-e）。

使用VACV天坛株进行活病毒中和实验以评估中和抗体反应。在初次接种后，中和抗体滴度略高于检测限，加强免疫后，中和抗体滴度提高了近2 log10（图2f）。两种测试结果显示，mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP之间的体液反应没有显著的统计学差异。综上，mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP均能够诱导抗MPXV的IgG抗体和抗VACV的中和抗体，且诱导小鼠产生体液免疫的效力相当。

图2接种mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP的小鼠体液免疫反应

04

mRNA猴痘疫苗诱导小鼠产生细胞免疫

T细胞免疫对抗病毒感染至关重要，研究人员进一步探索mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP免疫是否能够引发MPXV特异性的T细胞免疫。酶联免疫斑点（ELISPOT）结果显示，在接种疫苗的小鼠脾脏细胞中，IFN-γ（Th-1）、TNF-α（Th-1）和IL-2（Th-1）的分泌显著增加，而IL-6（Th-2）分泌水平无显著差异（图3a）。

MPXV感染主要由抗体控制，而记忆B细胞和记忆T细胞在猴痘疫苗的体液免疫反应中发挥着重要作用。通过测量MPXV特异性的生发中心（GC）B细胞、滤泡辅助T细胞（Tfh），以及CD4+和CD8+效应记忆T细胞（Tem），评估mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP诱导记忆细胞反应的能力。流式结果显示，与未接种MPXV特异性抗原刺激的小鼠相比，接种mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP小鼠的引流淋巴结（DLNs）中MPXV特异性的GC B细胞和Tfh细胞显著增加（图3b-c）。mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP在诱导MPXV特异性的CD8+Tem细胞比CD4+Tem细胞更为有效（图3d-e）。综上，mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP疫苗成功诱导了基于Th1的MPXV特异性细胞免疫反应，并引发记忆B细胞和记忆T细胞效应。

图3接种mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP小鼠的MPXV特异性细胞反应

05

MPXV四价mRNA疫苗的保护力

本研究基于萤火虫荧光素酶表达的VACV攻毒模型评估mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP在小鼠中的保护作用。主动保护评估实验中，两次肌肉注射mRNA-A-LNP或mRNA-B-LNP的小鼠，皮下注射攻毒VACV天坛株，24小时后通过生物发光成像（BLI）测量小鼠的病毒载量，结果显示接种疫苗的小鼠中生物发光信号几乎不可检测，而未接种小鼠的信号值高达6.5 log10（图4a-b）。

进一步评估免疫小鼠血清在体外和体内被动保护效果，在体外将免疫小鼠血清与VACV共孵育1小时，生物发光信号在免疫血清处理的小鼠中显著减弱（图4c-d）；在体内，裸鼠注射免疫小鼠的血清，再注射VACV，免疫血清处理的裸鼠仅在注射部位检测到微弱的荧光信号，而未免疫小鼠血清处理的裸鼠检测到明显的荧光信号（图4e、f）。综上，疫苗诱导的抗体在攻击后迅速清除VACV，具有主动保护作用；免疫小鼠的血清在体外能有效中和VACV且保护免疫缺陷小鼠免受VACV攻击，具有被动保护作用，表明免疫接种mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP能有效保护小鼠免受VACV感染。

图4mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP保护小鼠免受VACV攻击

06

MPXV四价mRNA疫苗的安全性

研究人员监测了小鼠体重记录、生化参数、先天细胞因子反应和组织病理学的变化，评估疫苗的安全性。在接种mRNA-A-LNP或mRNA-B-LNP后，小鼠体重迅速恢复，没有出现体重下降（图5a），注射部位未观察到皮肤炎症反应。基于血液生化参数评估了心脏、肝脏和肾脏功能，数据显示免疫组和对照组均在正常范围内，没有显著差异（图5b-f）。

进一步评估疫苗是否引发过度的炎症反应，在首次接种48小时后采清，检测免疫和未免疫小鼠血清中先天免疫反应相关的细胞因子IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-12和IL-1β的分泌水平，结果显示，接种疫苗小鼠血清中的细胞因子水平与未免疫小鼠没有显著差异（图5g）。对小鼠的多个组织进行组织病理学检查，经H&E染色的组织病理学切片之间没有差异（图5h）。注射疫苗未在小鼠中触发炎症反应，血液生化参数在正常范围内，组织学检查与正常组没有显著差异，疫苗呈现出足够的安全性。

图5MPXV四价mRNA疫苗在小鼠中的安全性评估

07

结语

本研究基于LNP的mRNA递送技术和基础研究识别的关键靶标（A29L、A35R、M1R和B6R），快速开发了两种新型的MPXV四价mRNA疫苗候选物：mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP。两种疫苗均能有效诱导小鼠产生特异性抗MPXV的IgG抗体和抗VACV中和抗体，诱发细胞免疫反应，接种疫苗可保护小鼠免受VACV的攻击，且具有良好的安全性。mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP是首批使用mRNA平台开发的猴痘病毒疫苗候选物，并提供对VACV等正痘病毒的交叉保护，为基于mRNA疫苗平台的猴痘病毒疫苗及其他正痘病毒疫苗开发提供新的思路和见解。

参考文献

[1] Sang, Y., Zhang, Z., Liu, F.et al. Monkeypox virus quadrivalent mRNA vaccine induces immune response and protects against vaccinia virus. Sig Transduct Target Ther 8, 172 (2023). doi: 10.1038/s41392-023-01432-5.

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撰写| 工程菌星球

校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Alice