投稿到接收，不到半年！罕见C-N键形成机制，登上Nature！

光酶中前所未有的C-N键形成机制

酶通过共价和非共价相互作用，能够以极高的选择性催化复杂反应，在化学合成中展现出独特优势。尽管天然酶已知具有涌现机制，但在非天然反应中较为罕见。最近的例子包括P411催化的氮烯插入C-H键和双环丁烷形成等。使用蛋白质工程可解锁新的反应和逆合成策略，例如通过氢胺化构建新C-N键。然而，超越模型基底的氢胺化反应（如1,1-二取代烯烃与胺偶联）仍面临挑战，特别是在构建α-叔胺时。过渡金属催化剂和自由基机制虽有官能团耐受性，但存在区域选择性问题。

在这里，普林斯顿大学Todd K. Hyster教授课题组报道了通过Baeyer-Villiger单加氧酶光酶促烯烃氢胺化制备2,2-二取代吡咯烷。五轮蛋白质工程提供了突变体，提供了优异的产物产量和立体选择性。与相关的光化学加氢胺化不同，光化学加氢胺化依赖于胺或烯烃的氧化来形成 C-N 键，这项工作利用了还原生成的苄基自由基和氮孤对电子对的全空间相互作用。这种反键相互作用降低了自由基的氧化电位，使电子能够转移到黄素辅助因子。实验表明，酶微环境对于实现小分子催化中无可比拟的新型 C-N 键形成机制至关重要。进行分子动力学模拟来研究酶活性位点中的底物，进一步支持了这一假设。这项工作是非天然生物催化中新兴机制的一个罕见例子，其中酶可以使用其单个组件无法使用的机制。作者的研究展示了利用蛋白质工程增强新兴机制的潜力，为化学合成中尚未解决的挑战提供独特的机械解决方案。相关成果以“Emergence of a distinct mechanism of C–N bond formation in photoenzymes”为题发表在《Nature》上。该论文4月16日投稿，9月30日接收，10月8日加急上线。

作者的目标是开发酶催化的分子内氢胺化来制备 2,2-二取代吡咯烷（图 1b）。研究人员已经证明，黄素依赖性“烯”还原酶可以催化各种具有区域选择性和对映选择性的 C–C、N–C和 C–O成键反应。使用蛋白质工程进行调整。这些反应的一个共同特征是需要活化的自由基前体，例如烷基卤和异羟肟酯，它们在还原时会发生不可逆的键断裂，以确保生产化学与反电子转移具有竞争性。在这项研究中，作者的目标是涉及未活化自由基前体的光酶过程，以提高光酶过程的合成效用

图1：自由基氢胺化的挑战

作者通过探索基于模型底物1的5-exo-trig和6-endo-trig自由基环化反应，发现来自醋酸钙不动杆菌的环己酮单加氧酶可以催化5-exo-trig加氢胺化产物的生成（图2a），尽管初始产率较低（1%）。通过蛋白质工程，作者利用迭代位点饱和诱变提高了产量和对映选择性。关键突变位点包括R327K、R490E、C326H和I491T等，它们调整了底物在酶活性位点中的位置。特别是A479H突变提高了产物的产率和对映选择性（97%）。分子动力学模拟表明，这些突变破坏了酶内环的门控作用，从而保持了活性位点的开放性，促进了底物进入。实验还表明NADP+对反应有抑制作用，阻碍了催化过程。

图2：蛋白质进化

作者测试了被称为AcHYAM的酶在多种底物上催化环化的能力（图3）。结果表明，富电子的芳烃底物通常表现出较高的产率和对映选择性，而大取代基和缺电子的含氮杂环也能被耐受。蛋白质工程有望克服某些杂环取代对环化的不利影响。同系底物可通过6-exo-trig环化反应，以13%的产率生成产物，并具有较高的对映选择性。此外，该方法成功用于制备多种医药分子的α-甲基化类似物，如TRK抑制剂和原肌球蛋白抑制剂，显示出优异的产率和对映选择性。机理研究表明，反应依赖于还原黄素辅因子，而非通过氮为中心的自由基引发，排除了双自由基组合作为成键机制的可能性。

图3：C-N形成反应的范围

作者得出结论，FADhq能够通过还原烯烃引发自由基反应（图4a）。正电荷的活性位点可以有效降低还原所需的电位，并稳定产生的黄素半醌（FADsq–）。生成的自由基阴离子具有高碱性，迅速质子化形成苄基自由基。虽然作者最初猜测自由基可能会进一步氧化为苄基阳离子，但实验表明，带有其他亲核试剂的底物并不反应（图4c），这表明反应不经过阳离子中间体，而是可能涉及π-π堆积相互作用。

作者假设苯胺和苄基自由基之间的相互作用会改变系统的氧化还原性质。虽然这种跨环相互作用在文献中尚未被报道，但类似的超共轭相互作用已知会提高自由基的能量，使其更容易氧化。通过密度泛函理论（DFT）计算，预组织中间体的分子轨道显示了C-N键形成的轨道重叠（图4d）。这些计算表明，预取向结构的氧化电位显著降低，使得FADsq–可以有效氧化自由基，支持作者对酶活性位点通过模板化底物相互作用来促进反应的假设。

图4：使用基质探针和 DFT 进行机理研究

根据观察结果和机制证据，作者得出结论，这种酶通过不同于小分子催化的机制促进氢氨化反应。这种新机制依赖于二中心三电子反键中间体的排斥相互作用，降低了酶活性位点中自由基的氧化电位。这种相互作用可能仅在蛋白质提供的预组织作用下发生。MD模拟表明，AcHYAM环境为底物提供了比亲本酶更大的旋转自由度，但仍能引导底物进入对C-N键形成至关重要的构象（图5a）。这种灵活性可能源于突变，使底物摆脱了母酶中常见的扩展构象。作者还发现，使用光催化剂虽然能将烯烃还原为自由基阴离子，但没有C-N键形成（图5b），这表明酶提供的模板对于反应至关重要。

图5：用分子动力学和小分子测试研究底物结合

小结：总之，本文开发了一种高选择性光酶，用于使用苯胺进行立体选择性氢胺化。根据实验和计算，作者得出结论：该反应利用了以前未知的 C-N 键形成机制，这是通过蛋白质活性位点提供的预组织实现的。这种 C-N 键形成的新机制凸显了酶揭示新途径的机会，这些新途径可用于解决化学合成中的反应性挑战。

来源：高分子科学前沿

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