养殖水体中氨氮降解菌的筛选与应用，对七彩神仙鱼的品质有何影响

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七彩神仙鱼隶属于鲈形目、慈鲷科、盘丽鱼属，原产于南美洲的亚马逊河流域，身体呈盘状，是观赏鱼中的名贵品种。

七彩神仙鱼是由五彩神仙鱼通过人工杂交、选育，从而培养出的优良品种，通过人工筛选出的七彩神仙鱼具有独特的特征：鱼体布满鲜艳的网状花纹或色块。因为其体色多样，形态优美，被众多国内外七彩神仙鱼爱好者称之为“热带观赏鱼之王”。本文针对七彩神仙鱼养殖水体中氨氮降解菌的筛选与应用进行研究。

七彩神仙鱼除了因体色鲜艳而备受宠爱之外，还因为性情文静、吃食量少，受到热带鱼养殖者的追捧。

目前我国的七彩神仙鱼养殖主要依靠室内循环水养殖，这种养殖模式具有环保和低成本的优点。

但是在封闭情况下，循环水养殖中氨氮浓度会经常出现偏高等问题，同时七彩神仙鱼喜欢牛心汉堡和红虫等饵料，这种鲜活饵料对水质的影响更加严重。为了解决这一问题，本文对七彩神仙鱼养殖水体中菌群结构和水质指标进行了研究。

七彩神仙鱼养殖水体微生物群落的演替规律

目前我国的七彩神仙鱼养殖主要依靠循环水养殖，这种养殖模式因环保和低成本被大部分养殖者接受。

这种养殖模式在国内主要养殖虹鳟大西洋鲑等少量名贵品种，在观赏鱼养殖方面缺乏相应经验。

但是在养殖过程中能发现在封闭情况下，循环水养殖容易出现氨氮浓度高等问题，同时七彩神仙鱼喜欢新鲜饲料喜食牛心汉堡和红虫等，但是这种鲜活饵料对水质的影响更加严重。

据研究显示水产动物只能吸收投入饲料中25%的蛋白，其他的就流失在水体中，随着养殖时间的增加。

如果不及时清理残饵和粪便，就会在水中加速腐败发酵，造成水体氨氮浓度升高，从而造成水体缺氧、导致水生动物发病、死亡等情况出现。

通常在养殖中除了基础的物理净化水质的方法，我们最常采用的是微生物的方法。在水产动物养殖中最常用的益生菌有光合细菌属、酵母菌属、芽孢杆菌属等。

养殖水体中也有很多本底的有益菌，能够分解水中的有机质

研究了七彩神仙鱼养殖过程中水环境微生物群落结构及多样性，基本展现出七彩神仙鱼养殖水体微生物群落以及环境因子的关系，为调控养殖环境中的微生物群落结构来改善水环境提供了依据。

七彩神仙鱼养殖缸(45cm×50cm×40cm)，水位27cm，七彩神仙鱼养殖密度10条/缸。试验过程中，缸内保持24h曝气，溶氧＞5mg/L，水温28±0.5℃，pH7.8±0.3。每天投喂饵料牛心汉堡(8:00、18:00)，并根据鱼的摄食情况进行调整，养殖期间不换水，不抽底。

取1L水样用混合纤维素滤膜（孔径0.22μm，探索平台）过滤，滤膜于液氮中暂存，保存在-80℃冰箱中。水质测定方法采用国标法。

将符合要求的水样滤膜进行16SrRNA高通量测序实验。分别用引物对338F(5'-AC-3')和806R(5'-GT-3')扩增细菌16srRNA基因高变区V3-V4。

试验数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用SPSS22.0统计软件进行单因素方差分析(One-WayANOVA)及Tukey多重比较，P＜0.05为差异显著。

为探讨水质于养殖水体中微生物群落的关系，对采集的水样进行了水质分析，

因为七彩神仙鱼属于热带观赏鱼，所以养殖期间水温一直维持在28℃，养殖水体的pH保持在七彩神仙鱼最适的7.0-8.0之间变化较小；在4d不换水的短周期养殖水体的氨氮值从0.4mg/L急速上升到1.2mg/L，

之后氨氮开始下降；亚硝酸盐含量前两天保持稳定，在0.0008mg/L左右，之后因为硝化作用开始迅速升高到0.0057mg/L。

硝酸盐和亚硝酸盐增长趋势保持一致前三天保持稳定，后期迅速上高，最高时达了0.79mg/L；总氮值出现缓慢上升趋势，在7.41-8.10mg/L之间变化；总磷变化范围在0.23-0.49mg/L。

测序信息统计及α多样性分析

本研究通过对正常养殖环境下（为避免数据的偶然性选取3个平行养殖水样）的15个样品进行高通量测序分析，为揭示七彩神仙鱼养殖水体中微生物群落结构的变化，利用优势OTUs进行对应分析。

得到原始数据后按最小样本序列数进行样本序列抽平共得到748个OTU，分别属于其中23个门，48个纲，117个目，215个科，406个属，527个种。在水样检测到变形菌门、拟杆菌门是主要优势门（>10%）。七彩神仙鱼养殖水环境微生物群落组成见表2-2所示。

对本研究的样品在OTU水平上进行Venn图分析，可以看出5个时间段的共同拥有的OTU数量较大达到了189个，0d组独有OTU最少，仅有7个、在第2、3、4d中独有的OTU分别有38个、31个、36个，在第5d组中独有OTU数量最多，有54个。

Alpha多样性如表2-3所示，在OTU水平上样品中物种的丰富度和多样性指数分析，第一时期的Ace显著低于后面四个时期，多样性Shannon、Shannoneven的变化都不显著。

不同时间水样间微生物在门水平上的结构变化

各个时期OTU水平上菌群丰度见图2-2所示。五个时期水体微生物优势菌

群为变形菌门、拟杆菌门占所有菌群丰度的75%以上，以及一些低丰度的放线菌门、厚壁菌门等。

对2种优势菌门在各时期所占比例统计结果如表2-4所示。变形菌门在第2d达到最高，于在第0d和第4d具有显著性差异（P<0.05），拟杆菌门在第1d最高，对比第0d，从第2-4d拟杆菌门丰度都有显著降低（P<0.05）。

不同时期水样间微生物在属水平上的结构变化在属水平分类变化不同时期的水样间优势细菌（丰度<10%的优势微生物）的组成及丰度存在明显不同。

在第0d中黄杆菌属的丰度最高，在优势菌群中占比38.79%，其次是属占比12.93%。在第1d中红杆菌属丰度最高，达到了36.77%，其次是一种未命名的罗德菌占比14.22%。

在第2d中新鞘脂菌属占比25.18%达到最高，其次红杆菌属，比例为17.97%。在第3d中红杆菌属丰度最高，达到20.40%，其次依次为新鞘脂菌属、不动杆菌属，比例分别为13.08%、10.93%。在第4d中，占比最高的为黄杆菌属，比例为18.31%，紧接着是红杆菌属占比16.76%。

从属水平上对以下 3 种优势菌属在各时期所占比例进行分析，所占比例统计结果如表 2-5 所示。红杆菌属在第 0d 时比例最低，几乎没有，在第1d时期最高，后逐渐降低，后期与第 1d 相比差异性不显著（P>0.05）。

黄杆菌属第 1d 与第 1、2、3d 均具显著性差异。鞘脂单胞菌属第 2d 较第 0、1、3、4d 都显著性差异（P<0.05）。

在属水平上绘制了所有时期的养殖水样菌落中丰度排名前20 的细菌种类的 Heatmap 图，可以看出菌群分布与上面的菌落 bar 图有相似结果；各组之间 3 中优势菌群丰度有相应变化，第 0d 以黄杆菌属占主要优势菌，第 2d 新鞘脂菌属占主要优势菌，其余 3 天水体中的优势菌群以红杆菌属为主。

七彩神仙鱼短期养殖中微生物群落结构 PCA 分析

第 3d 和第 4d 的微生物群落结构相似，第 1、2d 微生物群落结构

明显分离。第 0、1、2d 与第 3、4d 群落结构相似性不大。

运用 Spearman 分析进行了菌落和环境因子的相关性图见图 2-6，首先，从水体指标来看第 0d 与各种氮形态的水质指标相关性不大，但是随着时间的推移第 1、2d 与硝氮呈现正相关。

在 3、4d 中与各种氮形态都呈现较大相关性，特别是亚硝和氨氮，在水质变化中亚硝与氨氮的相关性较大；在所有样品中群落与氨氮的相关性最大。

根据图 2-7 显示：在所有差异菌属中与氨氮相关性最显著的是 和水沦菌属。

特别是芽孢杆菌属，前两种菌属与总氮和亚硝相关性也较高；和他们不同的是，沙壤土杆菌与硝氮相关性最显著；除此之外，新鞘氨醇属与总氮的相关性最为显著。

本研究将筛选出来的蜡样芽孢杆菌 B6 添加进七彩神仙鱼的养殖净水中，添加浓度分别为 1x10 6 cfu/mL、1x10 7 cfu/mL、1x10 8 cfu/mL，养殖 7d 后对水质指标再次进行测定。

结果表明：最高浓度 1x10 8 cfu/mL 条件下，氨氮降解率达到了 70%，亚硝氮降解率达到了 74%，对硝氮的降解率达到了 91%。这证明芽孢杆菌确实具有潜在的降氮作用。