宾夕法尼亚州立大学王勇教授团队 Nat. Biotech.: 聚乙二醇(PEG)水凝胶的新用途

适配体（短单链 DNA 或 RNA 分子）已被研究作为现成的“替代抗体”，用于各种应用，包括药物输送、生物材料设计、再生医学、分子成像和病原体检测。然而，从包含约 1015 个候选物的库中发现高质量适配体与抗体的设计和选择一样具有挑战性（有时甚至更具挑战性）。因此，自 1990 年第一个适配体选择方法发表以来，研究人员一直在寻找新颖、简单的方法来快速有效地富集适配体。已经研究了许多优雅的方法，包括基于微珠的选择、基于毛细管电泳的选择和基于微流体的选择。尽管有所改进，适配体选择仍然面临挑战，包括PCR扩增偏差、靶蛋白或候选适配体的构象变化以及适配体多样性低。特别地，与选择基质和靶蛋白的非特异性结合使得难以从适配体文库中去除非特异性候选物。

鉴于此，宾夕法尼亚州立大学王勇教授团队开发了一种三维大孔聚乙二醇（PEG）水凝胶，以固定靶蛋白作为适配体选择基质。因此，低亲和力候选适配体可以从水凝胶中快速释放，而高亲和力候选适配体由于其与固定蛋白靶标的强烈结合而受到限制。近日，该研究论文以题为“High-affinity one-step aptamer selection using a non-fouling porous hydrogel”论文发表在Nature Biotechnology上。

提出了一个简单的丰富和选择的方法，这是从根本上不同于现有的方法在概念上。它的工作原理是在一个无污染和高渗透性的三维空间中耦合扩散-结合过程。这个空间允许寡核苷酸的自由和快速扩散，没有非特异性结合或包埋。相反，高亲和力的适体候选物的扩散和释放受到限制，因为这个空间被合理地设计用于固定靶分子，候选物与固定的靶强烈结合。即使一个高亲和力的候选分子从一个目标分子解离出来，它也会沿着扩散途径在三维空间中重新结合到下一个目标分子，而不是在二维表面上。这种方法基本上相当于无需仪器，自动，迭代和顺序孵育-分区过程，不受非特异性结合，PCR 扩增偏倚或减少序列多样性。扩散结合模型首先用于评估具有不同结合亲和力的适体的三维转运行为，如解离常数的 Kd 值范围从1nM 到10μM。模型分析表明，所有的适体都是从固定有目标分子的多孔空间释放出来的。核酸适体的浓度不同，核酸适体在核心区的浓度较高，而核酸适体在核心区的浓度较低。然而，不同的适体表现出不同的空间分布和暂时保留率。例如，24小时 Kd 为1μM 的低亲和力适体的保留率为14.1% ，而 Kd 为1nM 的高亲和力适体的保留率为84.9% 。在60小时时，Kd 值从1nM 到10μM 的适体的保留分别为74.4% ，54.4% ，19.4% ，1.6% 和0.2% 。Kd 为1nM 的核酸适体的保留率是 Kd 为1μM 的核酸适体的46倍。因此，模型分析表明，由于扩散-结合过程的耦合作用，具有不同结合亲和力的适体在固定有靶分子的多孔空间中的保留概率有很大的不同。

图1. 用于适配体选择(HAS)的水凝胶

为了从适配体库中去除非特异性候选物，将库加载到这种大孔 PEG 水凝胶中进行自由扩散。研究人员选择 PEG 是因为它防污结的，与其他分子的结合最小，因此候选适配体与水凝胶的非特异性结合将最小化。此外，研究人员设计了PEG水凝胶的三维大孔性质，以允许非特异性候选物快速扩散出 PEG 水凝胶。相比之下，由于候选适配体和固定靶分子之间的强结合，只有特定的候选适配体才会保留在 PEG 水凝胶内。因此，研究人员假设使用研究人员开发的用于适配体库自由扩散的三维大孔 PEG 水凝胶将导致适配体快速富集，甚至可能一步完成。

图2. 水凝胶表征和适配体选择

使用下一代测序分析了60h从水凝胶中收集的适配子池。在这八个候选者中，T.7显示出最强的结合信号，其Kd为1.5 NM。该研究用一个简单的生物传感器来分析T.7的结合特异性。凝血酶与六种对照蛋白的比较表明，T.7显示出高结合特异性。由此可见，该研究通过一步HAS成功地发现了抗凝血酶适配子。全长T.7适体，即T.7(90)，具有多茎环二级结构。基于该二级结构，T.7被截短以产生六个较短的适体序列。用SPR对这些截短的序列进行检验。T.7(30)和T.7(45)表现出低结合强度，而其他四个截短适体表现出与原始T.7适配子类似的高结合亲和力。这种观察是预期的，因为全长适配子同时包含必需和非必需核苷酸，并且适配子将失去与去除的必需核苷酸的结合亲和力。SPR分析表明，T.7(40)表现出与15聚体和60-18(29)相当的结合亲和力。因此，数据表明HAS在一步筛选高亲和力适配子方面是有效的。

图3. 使用一步法HAS获得的候选适配体的分析

大多数蛋白质的等电点(pI)值在5到9之间。为了忠实地表明HAS可以作为凝血酶以外的其他靶标的技术平台，该研究选择了针对另外四种蛋白质的适体，其pI值范围为5至9。这些蛋白质是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) )、白细胞介素-12 (IL-12)、IL-10和脑源性神经营养因子(BDNF)，分别代表带负电、中性和带正电的分子。针对一系列具有不同电荷的蛋白质的适配体的成功选择表明，HAS方法对于发现针对不同靶标的适配体是有效的。

图4. GM-CSF、IL-12、IL-10和BDNF适配体的选择和表征

这项工作的一个明显限制是只使用了五种蛋白质来研究这个概念。为了进一步证明这项工作的潜力，有必要将该方法应用于非蛋白质靶标（包括具有更复杂结构的靶标，例如活细胞和病原体）。因此，接下来人们可以问的一个明显问题是如何使用这种方法来选择针对单个分子之外的活体和非活体生物体的适配体。例如，针对病毒（例如 SARS-CoV-2）的适配体的快速选择可能会导致诊断和治疗药物的实时开发。实现这一潜力可能需要直接使用此方法或调整此方法以满足特定的选择需求。

https://www.nature.com/articles/s41587-023-01973-8

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