中药药理-农林1区-天津科技大学等揭示山楂黄酮通过改善肠菌/血清代谢物缓解AD小鼠的认知障碍

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导读

山楂黄酮(HF) 对阿尔茨海默病 (AD) 具有潜在益处，但其作用机制仍不清楚。在这项研究中，我们确定了 HF 的主要成分，证明以每天 200 mg/kg 的剂量给予HF可显着改善由D-半乳糖和氯化铝诱导的AD小鼠认知缺陷。HF还有效改善了β-淀粉样蛋白 (Aβ) 的积累和海马小胶质细胞的异常激活。此外，我们通过 16S rRNA 测序和四极杆飞行时间质谱研究了HF对AD小鼠肠道微生物群和血清代谢组学的影响。我们的结果表明，HF 通过增加 Dubosiella、Alloprevotella和双歧杆菌的比例，降低不动杆菌的比例，以及增加二十二碳五烯酸 (DPA)、鞘脂 (SM) 和磷脂酰胆碱(PC) 的水平，来逆转 AD 小鼠的肠道菌群紊乱和代谢紊乱。值得注意的是，本研究首次观察到 DPA 和双歧杆菌之间存在正相关关系。因此，HF 可作为有前景的改善阿尔茨海默病症状的膳食补充剂。

论文ID

原名：Hawthorn Flavonoid Ameliorates Cognitive Deficit in Mice with Alzheimer’s Disease by Increasing the Levels of Bifidobacteriales in Gut Microbiota and Docosapentaenoic Acid in Serum Metabolites

译名：山楂黄酮通过增加肠道菌群中双歧杆菌和血清代谢物中二十二碳五烯酸的水平改善阿尔茨海默病小鼠的认知障碍

期刊：Food Function

IF：6.317

发表时间：2022.10

通讯作者：吴涛，张民

通讯作者单位：天津科技大学&天津农学院

实验设计

实验结果

1.山楂黄酮的组成

正负离子模式下的扫描色谱图如图S1所示。LC-MS原始数据导入MassBank、Inspect和GNP数据库，我们比较了组分名称、分子式、相对分子质量和相对面积 (%), 共得到 565 种化合物。其中，相对面积>1%的化合物有23种（表1）。山楂黄酮中含量丰富的化合物有芹菜素8-c-葡糖苷、4-二咖啡酰奎宁酸、芹菜素、芹菜素双糖苷、槲皮素、白花苷R1、金丝桃苷、虫草酸、胡桃苷等。

2.HF干预改善AD小鼠认知功能障碍

在 MWM 的第 2 天，与对照小鼠相比，AD 小鼠的逃避潜伏期增加（图 1A）。与AD小鼠相比，HF-L（低剂量）、HF-M（中剂量）、HF-H（高剂量）组的逃避潜伏期从第2天开始减少，从天开始与对照组相比无显着差异。各组在空间探索试验中的轨迹如图1D所示。 AD 小鼠在目标象限中停留的时间较少（图 1B），穿过平台的频率较低（图 1C），表明 AD 小鼠的记忆获取能力较差。然而，HF 补充剂改善了这种现象；同时，HF-M组与对照组在目标象限停留时间和平台穿越次数上无显着差异。这些结果表明，每天 200 mg/kg 剂量的 HF 可以显着改善 AD 小鼠的认知功能障碍。

表1使用LC-MS表征山楂黄酮

图1 HF对AD小鼠Morris水迷宫实验(MWM)的影响。(A)定位航行实验中的逃避潜伏期，(B)空间探索测试中在目标象限中花费的时间，(C)空间探索测试中穿越平台的次数，(D)小鼠在空间探索中的游泳轨迹测试。不同上标字母表示差异有统计学意义(p < 0.05)。

3.HF干预减轻AD小鼠氧化损伤

与对照组相比，AD组血清中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的含量显着降低，而丙二醛（MDA）含量显着升高（图2A-C）。 HF处理显着增强了抗氧化酶活性的降低和MDA含量的增加。值得注意的是，HF-M 组与对照组之间 SOD 和 MDA 含量无显着差异（P > 0.05），表明每天 200 mg/kg 剂量的 HF 可以改善 AD 老鼠中的氧化损伤。

图2 HF对AD小鼠氧化损伤的影响。(A–C) HF对AD小鼠血清SOD、GSH-Px和MDA水平的影响。不同上标字母表示差异有统计学意义(p < 0.05)。

4.HF干预减轻AD小鼠β1-42（Aβ1-42）淀粉样蛋白沉积

海马体中的 Aβ1-42蛋白被免疫荧光标记。如图 3A 所示，与对照组相比，AD 组的红色荧光强度增加，而 HF 干预后红色荧光强度降低。此外，定量分析表明，HF降低了AD小鼠海马体中的 Aβ1-42水平。HF-M、HF-H 和对照组之间没有显着差异（P > 0.05，图 3B），表明中高剂量的 HF 可以减少 AD 小鼠海马中的淀粉样蛋白沉积。

5.HF干预抑制了AD小鼠的炎症

用小胶质细胞标记物 IBA1+对小胶质细胞进行免疫染色显示，与对照组相比，AD 小鼠海马体中的 IBA1+上调和聚集。小胶质细胞体细胞的数量增加，显示出独特的异常激活反应（图 3C）。然而，中高剂量的HF显着抑制了AD小鼠海马体的异常激活。AD小鼠海马体TNF-α水平升高，HF-L组、HF-M组和对照组之间无显着差异（P > 0.05，图3D）。小胶质细胞在病理性大脑中产生细胞毒性细胞因子，例如 TNF-α，这些结果表明 HF 可以通过调节小胶质细胞的异常激活来抑制炎症。

图3 HF对小鼠海马体Aβ聚集和小胶质细胞激活的影响。(A)小鼠海马体中Aβ1–42的代表性免疫荧光染色(100×)；(B) HF对AD小鼠海马体Aβ1-42水平的影响；(C)小鼠海马体中IBA1+的代表性免疫荧光染色(100×)，(D) HF对AD小鼠海马体TNF-α水平的影响。不同上标字母表示差异有统计学意义(p < 0.05)。

6.HF干预调节了AD小鼠的结肠微生物群

我们选择了HF-M 组进行肠道微生物群和非靶向代谢组学分析。与对照小鼠相比，AD 小鼠的 Shannon 指数增加，而 Simpson、ACE 和 Chao1 指数降低（图 4A-D）。但HF-M组ACE指数高于AD组，而Shannon、Simpson、Chao1指数与对照组相比无显着差异。如图4E所示，对照组和HF-M组共享564个OTU，AD组和HF-M组共享535个OTU，表明HF-M组肠道菌群与对照组更相似。图4F还表明AD小鼠的细菌群落在HF干预后发生了变化。

图4 HF对AD小鼠肠道菌群多样性和丰富度的影响。(A) Shannon指数，(B) Simpson指数，(C) ACE指数，(D) Chao1指数，(E)维恩图显示各组肠道微生物群中的OTU，(F)基于非度量多维尺度(NMDS)三个实验组的OTU数据。不同上标字母表示差异有统计学意义(p < 0.05)。

在门水平上，与对照组相比，AD 组厚壁菌门的相对丰度显着降低，变形菌门的相对丰度显着增加（图 5B 和 D）。然而，HF-M干预扭转了这一趋势。在属水平上，circos 图显示所有组中的优势属是乳杆菌属、不动杆菌属、杜氏杆菌属、拟杆菌属和阿克曼氏菌属（图 5E）。 HF-M 增加了AD小鼠中 Dubosiella、Candidatus_Saccharimonas和双歧杆菌的丰度，并降低了不动杆菌、阿克曼氏菌、毛螺菌科_NK4A136_group和葡萄球菌的丰度（图 5F）。属水平的聚类热图显示 HF-M 重塑了 AD 小鼠的异常肠道微生物群（图 6A）。与 AD 组相比，Dubosiella、Coriobacteriales、Coriobacteriia、双歧杆菌目和双歧杆菌在 HF-M 组中显着富集（图 6B）。

图5 HF对AD小鼠肠道菌群组成的影响。(A)门水平的相对丰度，(B)厚壁菌门丰度的差异，(C)拟杆菌门，(D)变形菌门，(E) Circos图中属水平的主要肠道微生物群分布，(F)基因水平的相对丰度。不同上标字母表示差异有统计学意义(p < 0.05)。

图6 HF对AD小鼠异常肠道菌群的调节作用。(A)每组属水平前20名肠道微生物群的热图，(B) LEfSe分析确定肠道微生物群系统发育型，在AD和HF-M之间具有统计学上的显着差异。直方图表示LDA值高于2的谱系。

7.HF干预逆转了AD小鼠血清代谢紊乱

AD 组和 HF-M 组的代谢特征通过 OPLS-DA 分析显着分开（图 7A），表明 AD 小鼠的代谢物在HF-M处理后发生了变化。我们从人类代谢组数据库（Human Metabolome Database，HMDB）中筛选出潜在的差异生物标志物，共有23种生物标志物在 AD 和 HF-M 组之间显示出显着差异（P < 0.05，VIP > 1）。如图7B所示，与AD组相比，HF-M 组的二十二碳五烯酸 (DPA)、鞘脂 (SM)、磷脂酰胆碱 (PC)、磷脂酰乙醇胺 (LPE) 和溶血磷脂 (LPC) 水平较高，而琥珀酸、十六烷二酸、十四烷二酸、2-丁氧基乙酸、L-抗坏血酸 2-硫酸盐和 (R)-3-羟基肉豆蔻酸的含量较低。KEGG 和MetaboAnalyst 用于构建 HF-M 对 AD 小鼠影响的代谢途径。这些通路主要涉及氨基丁酸能突触、丁酸代谢、柠檬酸循环（TCA循环）、胰高血糖素信号通路、氧化磷酸化、乙醛酸和二羧酸代谢等（图7C）。

图7 HF对AD小鼠血清代谢的影响。(A) AD和HF-M组之间的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，(B) AD和HF-M组之间的表达谱热图（VIP > 1，P < 0.05），图中颜色表示该组样品中代谢物的相对表达量。左边是代谢物聚类的树状图。两个代谢物分支越近，它们的表达就越接近，(C) KEGG途径（AD与HF）。

8.结肠微生物群与血清代谢物之间的相互作用

我们使用热图分析了微生物丰度与差异代谢物之间的关系。在门水平上，厚壁菌门与DPA呈正相关，与DL-赖氨酸、琥珀酸、N1-哌啶羰基-4-甲基苯-1-磺酰胺和缬氨酸呈负相关。Octadec-9-ynoic acid, PC (20:3/20: 4)、SM (d18:1/18:0) 和 PC (16:0/17:1) 与Epsilonbacteraeota呈正相关，而 L-抗坏血酸 2-硫酸盐与Epsilonbacteraeota呈负相关。同时，肌酐与放线菌呈正相关；此外，N-乙酰-DL-色氨酸、十六烷二酸、PC (20:3/22:6)和 L-抗坏血酸 2-硫酸盐与变形菌门呈正相关（图 8A）。

在属水平上，DPA与双歧杆菌和气球菌呈正相关。肌酐与气球菌、Odoribacter、Coriobacteriaceae_UCG-002和Faecalibaculum呈正相关。 2-[3 甲基-2-(甲基亚氨基)-4-氧代-1,3-噻唑啉-5-yl] 乙酸与双歧杆菌和 Ruminococcaceae_UCG-014 呈正相关。不动杆菌与 octadec-9-ynoic acid 呈正相关，但与十四烷二酸呈负相关。不动杆菌和葡萄球菌与N-乙酰基-DL-色氨酸、PC（20:3/22:6）和L-抗坏血酸2-硫酸盐呈正相关。同时，(R)-3-羟基肉豆蔻酸与Lachnospiraceae_NK4A136_group呈正相关（图 8B）。

图8 AD和HF组血清代谢与肠道菌群的相关性。(A)门级相关性，(B)属级相关性。图右侧为肠道菌群名称，下方为相关代谢物名称。图中的每个网格代表两个属性（代谢物和关联特征）之间的相关性。红色表示正相关，蓝色表示负相关(*p < 0.05, **p < 0.01)。

AD 的病程是隐匿和进行性的，在观察到临床表现之前很久，患者的大脑就会发生病理生理变化，这些病理生理变化包括 Aβ 的积累、过度磷酸化 tau 蛋白的神经原纤维缠结以及小胶质细胞不受控制的激活，导致神经毒素和炎症因子的分泌。随着AD的发展，大脑皮层中的神经元和颞叶和海马体之间的连接丢失，导致认知和行为障碍。先前的研究报道了有多种天然产物 (NP) 可以通过抗炎、抗氧化和抗淀粉样蛋白生成的特性来缓解AD的发展。作为天然多酚化合物，类黄酮可以改善具有多个靶标的疾病。然而，HF在AD小鼠中神经保护活性的潜在机制尚未阐明。

MWM是评估小鼠认知能力的可靠行为实验，广泛应用于动物实验。在这项研究中，HF 缩短了 AD 小鼠的逃避潜伏期并增加了目标象限的停留时间和平台交叉次数，表明HF显着提高了AD小鼠的认知能力。

以往的研究表明，类黄酮在AD治疗中的应用有两个主要目的，即减少氧化损伤和β淀粉样蛋白的产生。AD患者的突触前膜因氧化应激而受损，导致学习和记忆能力下降。此外，研究表明，氧化应激增加和相关通路的激活可以促进 AD的发展。Aβ寡聚体通过特定受体在AD的破坏性循环中发挥神经毒性，而 42 个氨基酸长的 Aβ (Aβ1– 42) 是神经炎性斑的主要成分。Aβ1-42 通常会经历细胞降解，并通过广泛的链间氢键稳定的 β 折叠片的形成而形成细胞外聚集体，导致在一些患者的大脑中形成淀粉样原纤维和斑块，进一步诱发突触毒性。同时，Aβ沉积与AD患者和AD小鼠大脑中激活的小胶质细胞密切相关。小胶质细胞是神经元功能和体内平衡的调节器，负责在正常生理条件下吞噬Aβ。然而，异常激活的小胶质细胞通过触发多个促炎级联反应诱导神经毒性和突触丢失，以及在此过程中产生的炎性细胞因子，这些炎性细胞因子又会反过来损害小胶质细胞的吞噬作用。在本研究中，HF 改善了氧化损伤和 Aβ1-42沉积并抑制了异常的小胶质细胞激活。这些结果表明，HF 的神经保护作用可以通过减少氧化损伤、有毒蛋白质沉积和神经炎症来实现。

肠道通过免疫系统、色氨酸代谢、肠道神经系统和迷走神经连接大脑。我们发现HF-M增加了AD小鼠肠道微生物群的丰富度和多样性。先前的研究表明，在AD患者中厚壁菌门的丰度显着降低，而变形菌门的丰度显着增加，与我们的结果一致。另一项研究也证实，厚壁菌门Aβ沉积呈负相关。变形菌可引起免疫紊乱，从而促进促炎细胞因子的产生。然而，AD小鼠体内厚壁菌门和变形菌的丰度在 HF-M 干涉后恢复到基础水平。不动杆菌的毒力主要表现为破坏机体的免疫防御，可触发脂多糖 (LPS)-toll 样受体 4 (TLR4) 介导多种疾病。相比之下，Dubosiella是一种产生 SCFA 的细菌，与丁酸盐呈正相关，与 IL-1、IL-6 和 TNF-α 表达呈负相关。然而，HF-M 也逆转了 AD 小鼠中不动杆菌丰度的增加和Dubosiella丰度的降低。此外，HF-M 组中Alloprevotella和双歧杆菌的比例高于对照组。先前的研究报道，补充双歧杆菌可以减轻记忆和学习障碍，以及提高AD 患者的简易精神状态检查分数。这些数据表明，HF 可以通过重新平衡肠道微生物群和增加益生菌来改善AD。

HF-M调控的代谢途径主要集中在脂质代谢，代谢物如DPA、SM、PC、LPE、LPC在AD小鼠体内均显着升高。作为长链多不饱和脂肪酸家族的一员，DPA 可以降低炎症因子和小胶质细胞标记物的mRNA表达。先前的研究表明，DPA 可以通过PS1早老素途径改善 3xTg-AD 小鼠中Aβ和tau引起的损伤，相关性分析表明，DPA 与厚壁菌门、双歧杆菌和气球菌呈正相关。这些发现表明，HF-M 可能通过增加厚壁菌门和双歧杆菌的比例来提高 DPA 水平，从而改善 AD 小鼠的认知障碍并减少 Aβ 沉积。作为细胞膜中最丰富的鞘脂，SM 是膜稳态和炎症的调节剂。PC 和磷脂酰乙醇胺 (PE) 在细胞膜信号的识别和转导中也起着重要作用，它们被水解生成 LPC 和 LPE 。PC可以保护神经元免受 Aβ 的毒性作用，而 LPC 可以抑制LPS介导的炎症反应和小胶质细胞的异常激活。因此，HF可以改善小胶质细胞的异常激活，减少炎症，并通过调节磷脂来保护细胞膜AD小鼠的代谢。此外，HF-M 降低了AD小鼠体内一些有毒代谢物的水平。其中，(R)-3-羟基肉豆蔻酸可引起肝脂毒性，诱导氧化应激并引发线粒体功能障碍。Duchenella2-丁氧基乙酸可引起细胞损伤，增加细胞复制和角化。十六烷二酸和十四烷二酸也被报道会引起线粒体肿胀、呼吸道刺激、脂质代谢紊乱和氧化应激等。目前的研究发现，十四烷二酸与Dubosiella呈显着负相关，十六烷二酸与变形菌和不动杆菌呈显着正相关。因此，HF-M 可能通过降低十六烷二酸和十四烷二酸的水平来减少 AD 小鼠体内致病菌的丰度和炎症。

总之，补充HF可以显着改善认知障碍，减轻氧化损伤、Aβ 聚集和小胶质细胞异常激活。此外，HF改善了AD小鼠的肠道菌群紊乱和代谢紊乱。双歧杆菌和 DPA 被认为是改善AD认知障碍的关键因素。然而，特定基因改变肠道微生物群和代谢物的机制尚不清楚，需要进一步研究。因此，HF 可能是一种潜在的天然产物和膳食补充剂，可通过多个靶点来缓解 AD 的发展。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36373486/

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