Nature Protocols | 香港中文大学姜里文团队开发植物体外囊泡重组系统

责编 | 王一

囊泡运输是真核细胞中高度保守的生物学过程，对维持真核生物的生长发育至关重要。传统分子遗传学方法研究调控囊泡形成及运输的分子机制具有较大的局限性，生化手段的缺失更是极大的限制了细胞生物学的发展。体外囊泡重组技术的横空出世，彻底打破了这一瓶颈，为现代细胞生物学发展奠定重要基础。2013年诺贝尔生理医学奖获得者James Rothman及其同事Lelio Orci （已故） ，通过体外重组系统首次鉴定出从高尔基体上出芽的运输小泡为COPI囊泡，揭示了高尔基体蛋白转运的分子机制。另一获奖者Randy Schekman，则利用体外囊泡重组技术发现了介导内质网到高尔基体蛋白质转运的运输小泡COPII，鉴定了调控COPII囊泡形成的关键蛋白，并在后续的研究中利用该系统进一步揭示不同COPII组分的同源蛋白在不同类型人类疾病发生过程中的关键作用。最近，体外囊泡重组系统被进一步巧妙的运用到自噬研究中，生化水平上进一步阐明了自噬体形成的分子机制及膜来源。

近年的研究逐步揭示囊泡运输对植物生长发育，生殖，及应对生物与非生物胁迫的关键作用。然而有效生化手段的缺乏，尤其是体外囊泡重组系统的缺失，极大的限制了植物囊泡运输研究领域的发展。香港中文大学姜里文研究团队在Nature Protocols杂志发表了题为In vitro reconstitution of COPII vesicles from Arabidopsis thaliana suspension cultured cells的实验指南，首次详细介绍了植物体外囊泡重组系统的建立及实验方法。

文章首先详细的介绍了植物细胞器与细胞质蛋白的纯化过程。通过比较不同的细胞破碎方法，作者发现与利用液氮破碎细胞相比，使用注射器针头破碎细胞能高效的破裂原生质体细胞得到匀质化的膜组分，用于蔗糖梯度密度离心富集较纯的目标细胞器。结合不同细胞器标记蛋白的抗体，该方法可用于不同类型细胞器的纯化分离，为鉴定不同植物目标蛋白细胞内定位提供可靠的生化手段。通过系统优化，该方法还可被运用于水稻，玉米，烟草等植物与作物的细胞器分离。文章接着详尽描述了体外囊泡重组系统的反应条件，反应体系，及体外形成囊泡的分离纯化方法。与抗体依赖的免疫分离方法相比，体外囊泡重组系统可高效的得到大量纯化的植物运输囊泡。囊泡总量的提升，对研究植物囊泡形态结构、脂成分、及蛋白质组分至关重要。更重要的是，该系统可通过从不同激素与非生物胁迫处理的细胞中提取细胞器与细胞质蛋白进行体外囊泡重组反应，揭示植物应对逆境胁迫过程中囊泡形成的分子机制。最后，文章介绍了植物囊泡冷冻电镜样品的制备过程。如何高效的富集囊泡用于冷冻电镜观察是亟待解决的问题，本方法通过气体辉光放电 （Glow Discharge） 处理石墨烯支持膜覆盖的电镜网格 （EM grid） ，使电镜网格表面带负电而亲水化，用于囊泡的沉降富集。利用该方法成功富集大量的纯化囊泡用于形态结构分析，也为将来进一步解析囊泡复合体蛋白的结构奠定技术基础。该系统在植物中的建立，首次揭示了植物COPII囊泡的形态结构及其分选转运的蛋白。更为重要的是该系统被应用于研究不同逆境胁迫中，COPII囊泡的形成差异，并鉴定到了一种全新类型的植物COPII囊泡。

文章同时展望了该系统用于不同类型的植物囊泡 （COPI及CCV） 的体外形成，及其在不同类型植物与作物中应用的前景 。通过对该系统进一步优化，作者已成功在体外诱导拟南芥COPI和CCV的形成。而COPII囊泡形成系统也初步在烟草及水稻系统中建立，为研究作物囊泡运输提供新的技术手段。

论文第一作者为李白颖博士和曾咏伦博士，研究助理卢思颖、香港科技大学郭玉松副教授参与了该工作，姜里文教授为论文的通讯作者。该项目得到国家自然科学基金重点项目、香港研究資助局、以及裘搓基金会支持。

姜里文团队深耕植物囊泡运输领域，近年来多项研究成果揭示COPII囊泡在植物生长发育以及应对逆境胁迫过程中的重要功能，成果发表于PNAS （2015，2021） ，Nature Plants （2021） 、Nature Protocols （2022） ，Trends in Plant Science (2016) 等期刊，姜老师实验室常年招收博士研究生与博士后。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41596-022-00781-9