NAR | 上海科技大学高冠军团队开发简单、高效的大片段knockin基因编辑器——TEd

CRISPR-Cas系统介导的“基因编辑”前沿生物技术的开发与应用已引起了全世界的广泛关注，各种各样依赖于HR同源重组途径的基因编辑器已经能够实现DNA的精准插入或基因敲除，这不仅促进了生物医学的基础研究，同时为多种遗传疾病的治疗带来了巨大的临床应用前景。然而哺乳类动物细胞中对于长片段DNA （尤其是10kb以上） 的精准插入 （或删除） 效率却非常低，这严重阻碍了CRISRP技术在大片段基因编辑时的操作可行性。

2022年8月5日， 来自上海科技大学生命学院的高冠军团队在Nucleic Acids Research在线发表题为Transcription-coupled donor DNA expression increases homologous recombination for efficient genome editing的研究论文，报道了一种名为“TEd”简单、高效的基因编辑方法（Transcription-coupled Editor, TEd转录耦合编辑器） 。 该研究通过在传统HR-donor (HR-供体) 上引入转录过程以改变DNA修复过程中的供体染色质结构状态来促进同源重组的发生，从而实现细胞内大片段DNA的高效编辑。

该研究团队一直从事基因编辑技术的开发和应用，如GFP荧光标签的插入等。团队于2018年在细胞中融合表达Cas9与RT逆转录酶，然后通过在HR供体质粒上提供一个启动子以期能够转录与同源DNA互补的RNA分子，而后测试逆转录酶是否能够以RNA分子为模板直接合成相应的大片段，从而完成靶基因高效的knockin。随后的研究发现，此种依赖于RT逆转录酶的设计不能在大片段knockin上实现编辑效率的提升。然而，研究者却意外发现处于转录状态的HR-donor DNA能显著促进同源重组修复，团队据此提出通过人工引入转录过程以期改变DNA修复过程中的HR-供体的染色质结构状态，从而测试HR供体DNA结构状态的改变是否可以提高大片段DNA的插入效率。实验先后在哺乳类细胞的几个测试基因位点中均发现，处于转录耦合状态的供体DNA能够显著提高GFP的精准插入效率，团队将其命为转录偶联基因编辑器TEd。

图A, 转录偶联编辑器TEd与传统编辑方法CEd的差别。图B, 使用TEd系统的细胞中可以观察到有较CEd更多的环绕核膜的GFP荧光信号出现（LMNA-GFP整合），表明TEd系统可以更高效地在目标位点插入GFP标签。

团队随后基于上述发现设计开发了一系列优化的TEd基因编辑系统，通过在同源供体DNA上引入启动子以形成TC-donor （Transcription-Coupled HR-donor） ，并在其转录产物TC-RNA的3’端添加多个MS2茎环结构以及在Cas9上融合MS2适配体的结合结构域 （MCP） ，团队发现优化后的TEd系统在几种哺乳类细胞中的编辑效率相比于传统CRISPR-Cas9介导的编辑方法 （CEd） 均有更大幅度的提高 （TEd方法对于GFP的精准插入可以达到传统方法CEd的10倍左右） ，并在高达10kb的DNA片段敲入方面也获得了很好的效果 （传统CEd方法对于5kb片段靶向插入已非常困难） 。不过，TEd方法的应用还受限于其TC-donor的转录方向。研究发现，TC-donor的转录方向对TEd编辑效率具有重要影响，仅当TC-donor的转录产物互补于对应gRNA的非靶向链时，TEd介导的基因编辑效率才相比经典CEd方法具有显著效率提升，这提醒研究者在后续实际应用中应当注意TEd系统的整体设计。

总而言之，研究者首次通过引入启动子改造HR-donor开发出了转录偶联新型基因编辑器TEd。通过一系列优化，TEd初步解决了传统CRISPR-Cas9介导的同源重组在大片段knockin效率低的问题。此外，TEd方法对于基因删除、取代、点突变较传统方法都有显著提高，这为TEd将来在临床治疗方面的应用奠定了基础。同时，团队大胆预测TEd转录偶联编辑器可能同样适用于其它物种。

上科大高冠军课题组博士后张雪迪和研究生高凯旋为该论文的共同第一作者，高冠军教授为该论文的通讯作者。目前该团队欢迎对基因编辑方向感兴趣的青年才俊加盟实验室 （提供博士后或科研助理岗位） 。

https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac676/6656067