肿瘤突变负荷（TMB）：生物标记物的漫漫征途

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TMB概述

随着分子生物学，免疫学以及二代测序技术的发展，肿瘤的免疫机制得到了很好的研究。目前肿瘤治疗方法除了手术、化疗、放疗等传统治疗手段，免疫治疗已飞速发展，如免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICI）治疗，过继性免疫细胞疗法（Adoptive Cell Transfer Therapy, ACT），肿瘤疫苗和非特异性免疫刺激[1]。

肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden, TMB）定义为肿瘤样本中每百万DNA碱基突变的数量。TMB的概念起源可追溯至Alexandrov LB等人2013年发表于Nature的研究结果[2]，其根据全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）及全外显子组测序（Whole Exome Sequencing, WES）对30个癌种超过七千例样本进行了突变图谱分析，得到了所有样本每百万碱基的突变数量 （图1）。TMB反映了肿瘤细胞基因组的变异程度，高TMB（High Tumor Mutational Burden, TMB-H）的肿瘤患者具有获得更多新生抗原的潜力，并且与肿瘤内异质性有关，理论上高TMB能增强肿瘤免疫原性以及与ICI的反应。许多研究表明，高TMB与高免疫治疗获益相关。2020年6月，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准了帕博利珠单抗（Pembrolizumab）应用于具有高TMB的不可切除或转移的实体瘤治疗[3]，使TMB成为了重要的免疫治疗用药指标。然而，也有不少研究显示，高TMB受试者并不能从免疫治疗中获益。TMB是否能作为可靠的生物标志物，目前在学术上或许仍存在分歧。

图1 The prevalence of somatic mutations across human cancer types [2]

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如何得到肿瘤TMB?

目前检测TMB的金标准是使用二代测序的WES技术及相应的生物信息分析方法。但WES具有成本高，分析时间长，计算资源消耗大等难点，因此使用NGS panel计算TMB值也成了许多研究者的选择。NGS panel需要经过一系列的模型建立，突变位点的筛选和过滤，使TMB值接近相同样本的WES TMB值，或使两者保持高相关性。如FoundationOneCDx （F1CDx）保留了同义突变，过滤了热点突变，被判定为胚系突变的变异和抑癌基因的截断突变；MSK-IMPACT则使用了与WES相似的生物信息学计算方法[4]。

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TMB能够作为生物标志物吗？

Snyder A等人于2014年发现，受试者的免疫治疗响应率与其肿瘤突变的数量有一定的相关性，该研究是首个指出免疫治疗与TMB具有相关性的研究。随后，大量的研究也表明，高TMB值预示了受试者会获得更好的免疫治疗效果[5]。Hellmann MD等人将WES样本中突变数量大于158的定义为TMB-H，随后研究了纳武利尤单抗（Nivolumab）与伊匹木单抗（Ipilimumab）联合治疗非小细胞肺癌的效果。结果表明TMB-H患者具有更好的治疗响应[6]。Samstein RM等人在10类肿瘤类型中收集了约1600份接受了ICI治疗的受试者样本，使用MSK-IMPACT panel进行TMB计算。结果表明，大部分肿瘤中，处于TMB顶部20%的受试者相对于其他80%的受试者能够显著获得治疗效果，顶部10%的受试者则能更加显著地获得治疗效果[7]。

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TMB不能作为生物标志物吗？

然而，不少研究者也给出了截然不同的结论。Rizvi H等人研究了约2400例接受了PD-1抑制剂单药治疗或联合CTLA-4抑制剂治疗的非小细胞肺癌患者样本，使用WES和MSK-IMPACT panel计算TMB，结果显示TMB-H与TMB-L（Low Tumor Mutational Burden，低TMB）患者在PFS（Progression Free Survival，无进展生存期）上没有显著差异（P > 0.05）[8]。CheckMate 227研究结果显示，纳武利尤单抗在高TMB受试者中的PFS相对于化疗治疗的高TMB受试者并没有显著提高[9]。

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TMB路在何方？

首先，确保计算TMB的方法学准确性仍然是关键，准确的TMB值才能真实反应科学研究的生物学意义。研究者若使用NGS panel计算TMB，则应选择在产品设计上适用于TMB的panel。专家共识指出，一般认为检测的基因数目越多，TMB的检测值与WES的一致性越好， NGS panel≥0.8 Mb可以较好的评估TMB值。并应包含符合以下标准的基因：

1）权威指南推荐和有高等级循证医学证据的基因；

2）有高质量研究支持的上述基因相关的上下游通路基因；

3）与免疫治疗相关的基因，包括可能的敏感基因，原发或继发耐药基因，与免疫超进展发生相关的基因；

4）与TMB相关的基因[10]。

在生物信息学算法上，准确识别肿瘤细胞的突变是重中之重，如何最大限度地排除假阳性、假阴性变异位点对TMB计算的干扰依然是关键。此外，NGS panel还需要大量的数据进行算法训练从而建立适用于本panel的变异位点筛选模型。对于区分高、低TMB的cut-off值，专家共识指出，各免疫治疗药物应根据各自临床研究数据确定cut-off值，并进行前瞻性验证[10]。

其次，TMB与其他的生物学特征组合成为联合标记物有可能成为TMB研究的新思路。Liu L [11]等人收集了约500例经ICI治疗的泛癌受试者样本，经生物信息学分析得到了TMB与CNA（Copy Number Alteration，拷贝数改变），随后分成了高TMB高CNA（TMBHighCNAHigh），高TMB低CNA（TMBHighCNALow），低TMB高CNA（TMBLowCNAHigh），低TMB低CNA（TMBLowCNALow）四组。他们发现，在使用CTLA-4抑制剂治疗的皮肤黑色素瘤受试者中，TMBHighCNALow 组的生存期（OS）和客观缓解率（ORR）显著高于TMBLowCNALow，TMBHighCNAHigh，TMBLowCNAHigh组(OS：not reached vs.13.99 vs. 14.6 vs. 10.43 months，P=0.003，图2；ORR：75% vs. 32.4% vs. 39.7% vs. 18.9% ，P<0.001，图3)。

图2 Kaplan–Meier curves of OS and PFS according to different subgroups of TMB and CNAs combination in patients receiving ICI treatment[11]

在使用PD-1抑制剂治疗的非小细胞肺癌受试者中，TMBHighCNALow 组的生存期和客观缓解率也显著高于其他组（OS：6.45 vs. 4.33 vs. 3.23 vs. 2.60 months，P=0.012，图2；ORR：38.0% vs. 19.2% vs. 22.0% vs. 11.8%，P=0.032；DCB：53.6% vs. 33.3% vs. 33.3% vs. 14.1%，P=0.001。图3）。结果表明TMBHighCNALow有潜力作为一种联合生物标志物应用于ICI治疗。

图3 Joint relationship of TMB and CNAs with ICI treatment response[11]

参考文献

1) 顾文慧, 周丽云, 韩双印. 肿瘤免疫检查点抑制剂治疗相关标志物的研究进展[J]. 医学食疗与健康. 2021,019(009):218-221.

2) Alexandrov LB, Nik-Zainal S, Wedge DC, et al. Signatures of mutational processes in human cancer [J]. Nature. 2013,500(7463):415-21.

3) US Food and Drug Administration. Highlights of prescribing informationL KEYTRUDA [EB/OL].https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2020/125514s068lbl.pdf

4) Xu Z, Dai J, Wang D, et al. Assessment of tumor mutation burden calculation from gene panel sequencing data [J]. Onco Targets Ther. 2019,12:3401-3409.

5) Snyder A, Makarov V, Merghoub T, et al. Genetic basis for clinical response to CTLA-4 blockade in melanoma [J]. N Engl J Med. 2014,371(23):2189-2199.

6) Hellmann MD, Nathanson T, Rizvi H, et al. Genomic Features of Response to Combination Immunotherapy in Patients with Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer [J]. Cancer Cell. 2018,33(5):843-852.e4.

7) Samstein RM, Lee CH, Shoushtari AN, et al. Tumor mutational load predicts survival after immunotherapy across multiple cancer types [J]. Nat Genet. 2019,51(2):202-206.

8) Rizvi H, Sanchez-Vega F, La K, et al. Molecular Determinants of Response to Anti-Programmed Cell Death (PD)-1 and Anti-Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1) Blockade in Patients With Non-Small-Cell Lung Cancer Profiled With Targeted Next-Generation Sequencing [J]. J Clin Oncol. 2018,36(7):633-641.

9) Hellmann MD, Ciuleanu TE, Pluzanski A, et al. Nivolumab plus Ipilimumab in Lung Cancer with a High Tumor Mutational Burden [J]. N Engl J Med. 2018,378(22):2093-2104.

10) 中国临床肿瘤学会血管靶向治疗专家委员会，中国临床肿瘤学会非小细胞肺癌专家委员会. 肿瘤突变负荷应用于肺癌免疫治疗的专家共识 [J]. 中国肺癌杂志. 2021,024(011):743-752.

11) Liu L, Bai X, Wang J, et al. Combination of TMB and CNA Stratifies Prognostic and Predictive Responses to Immunotherapy Across Metastatic Cancer [J]. Clin Cancer Res. 2019,25(24):7413-7423.

来源：基因谷