FSHW | 3D生物打印中卵白蛋白/明胶生物墨水的制备及其在培养肉原位组织培养中的应用

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Abstract

3D生物打印是一项新兴的组织工程技术，其打印参数已得到升级优化，能够在细胞培养肉领域实现深度应用。然而，目前迫切需要开发适用于细胞培养肉的、兼具优异可打印性与可食用性的生物墨水。为此，本研究开发了一种以卵白蛋白和明胶为基础的低成本生物墨水。首先，通过流变学分析确定该生物墨水具备适宜的可打印性；同时，借助吸水率测试与降解速率测试，证实了由该生物墨水打印形成的支架具有出色的机械稳定性。其次，通过细胞增殖培养、细胞状态研究以及组学分析，明确了该支架的生物相容性及其与细胞间的相互作用机制。值得注意的是，AG7展现出更优的可打印性，而AGS7则为细胞黏附、增殖与迁移提供了更有利的微环境。S型指数生长曲线进一步表明，AGS7支架在细胞培养方面具有显著优势。更为重要的是，本研究将肌肉细胞的组织培养过程模拟拓展至类器官培养层面，阐明了细胞与支架之间相互作用的关键信息。该研究成果填补了行业内相关领域的空白，为细胞培养肉的产业化生产开发提供了一种全新策略。

Introduction

细胞培养肉，又称生物培养肉，是近年来兴起的一种颠覆性肉类生产技术。目前，大多数培养肉以肉馅形式存在，业界普遍认为，采用组织工程技术构建3D肌肉组织或将成为解决这一问题的理想方案。3D生物打印作为一种通用工程技术，可用于制备具有特定结构和形状的3D构建体。通过计算机辅助设计，能够精准控制细胞与生物材料的排布位置，进而逐层快速构建出与天然组织相似的人工组织结构。尽管3D生物打印技术在人工组织构建领域展现出广阔前景，但其生物墨水存在的可打印性差、可食用性不佳等问题，却限制了该技术在细胞培养肉领域的应用——这些问题易导致构建体结构不稳定，并带来生物安全性风险。此外，细胞的黏附、增殖及迁移效果也与生物墨水的性能密切相关。因此，开发具备优异可打印性与生物相容性的生物墨水，对于构建理想的3D肌肉组织至关重要。

根据近期部分研究，卵白蛋白是一种可食用且成本低廉的生物大分子。因其含有卵清蛋白、卵转铁蛋白、卵类黏蛋白等多种成分，有助于细胞黏附与增殖，进而可提升所制备支架的整体生物相容性，并促进细胞增殖与黏附。因此，卵白蛋白可被视为制备生物墨水的潜在可用材料。然而，由于卵白蛋白含水量高且化学性质不稳定，其自身不具备可打印性，需与其他成分复配使用。明胶是一类已知的大分子亲水性胶体，由胶原蛋白部分水解制得。凭借适宜的流变特性与优异的生物相容性，明胶被广泛应用于基于挤出成型的3D生物打印中，用于制备细胞支架。但遗憾的是，明胶具有温度敏感性相变特性：当温度升至25～35 ℃时，明胶易从凝胶态转变为溶液态。这种特性对支架的结构稳定性保持构成了重大挑战。因此，通过物理或化学方法对明胶基支架进行交联处理以提升其稳定性，是十分必要的。

图1 （A）卵白蛋白/明胶墨水的制备及三维支架打印与交联流程示意图；（B）不同墨水的流变学特性；（C）三维打印支架的扫描电镜图像

本研究中，如图1A所示，通过将明胶溶液与卵白蛋白混合，制备出一种新型复合生物墨水，并利用3D打印技术构建了支架。打印完成后，研究采用低浓度戊二醛进行支架固化：戊二醛可与（支架材料中）赖氨酸和羟赖氨酸残基的ε-氨基发生反应，形成席夫碱，进而进一步提升支架的稳定性。研究通过流变学分析评估该生物墨水的适宜可打印性，具体分析指标包括储能模量（G’）、损耗模量（G”）及剪切变稀行为；同时，通过可打印性测试进一步验证了生物墨水的打印性能。此外，借助吸水率测试与降解速率测试，对支架的机械稳定性进行了评估。最后，为将该支架应用于肌肉细胞的组织培养，研究通过细胞增殖培养、细胞状态分析及组学分析，系统评估了支架的生物相容性及其与细胞间的相互作用。本研究为利用3D生物打印支架生产细胞培养肉提供了一种新方法。

Results and Discussion

生物墨水的流变学分析

为制备可用于打印的生物墨水，本研究将从新鲜鸡蛋中提取的纯卵白蛋白与不同浓度（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%）的明胶溶液混合搅拌，得到均一液态的混合物，用于后续表征实验。

首先，通过流变学分析对所制备生物墨水的流变特性进行评估。如图1B1所示，当剪切速率从0.1 s⁻¹增至100 s⁻¹时，所有生物墨水的黏度均呈下降趋势，表现出典型的剪切变稀特性。此外，随着明胶含量的增加，生物墨水的黏度显著升高。

如图1B2和B3所示，所有生物墨水的储能模量与损耗模量均在4～40 ℃的温度范围内进行了表征。在整个测试温度区间内，所有生物墨水的储能模量均持续高于损耗模量，这表明生物墨水始终维持着稳定的类凝胶状态。此外，值得注意的是，AG5、AG7和AG10的储能模量在约15 ℃时出现显著下降，这一现象归因于温度升高导致明胶分子间氢键作用减弱。该结果表明，更高浓度的明胶有助于提升生物墨水的稳定性。

3D打印支架的制备与表征

通过流变学分析，已证实所制备生物墨水具备剪切变稀特性与机械稳定性。随后，研究将该生物墨水用于3D打印以构建支架。具体流程如下：将制备好的生物墨水装入注射器中进行3D打印，同时加入低浓度戊二醛溶液（0.25%）进行交联处理，最终成功制备出AGS2、AGS5、AGS7 和 AGS10 系列支架，用于后续表征实验。

本研究采用扫描电镜对所有支架的表面及内部形貌进行表征分析。如图1C所示，经戊二醛交联后，所有支架的表面形貌均呈现出稳定的单层片状结构，且支架内部具有多孔结构。通过测量可知，随着明胶含量的增加，支架内部孔径显著减小。

图2 采用不同墨水进行三维打印，并评估三维打印支架的力学性能

如图2A所示，研究人员采用多种生物墨水，通过基于挤出成型的3D打印机构建3D结构。如图2B所示，随着明胶含量的增加，打印结构的Pr值从0.76逐步升高至1.19。值得注意的是，AGS7的Pr值接近1，这表明明胶在一定程度上对提升可打印性具有积极作用。

如图2C所示，生物墨水打印丝束的厚度先降低后升高。其中，AG7表现出更低的厚度分布差异，且其丝束厚度更接近打印头直径，这有利于实现均匀挤出并获得更高的打印质量。综上，结果表明AG7生物墨水具有更优异的打印性能，且适当增加明胶含量对提升生物墨水的可打印性与均匀性具有积极影响。

如图2D所示，所有支架均表现出显著的吸水能力。其中，AGS2支架的溶胀率最高，AGS10支架的溶胀率最低，这一差异主要归因于二者内部孔径的不同。

如图2E所示，研究人员对各支架在磷酸盐缓冲液中的降解性能展开了测试：在初始5～10 d内，由于支架基质中未交联的明胶与卵白蛋白发生溶解，所有支架均呈现出加速降解的特征；而在10～40 d期间，其质量损失速率逐渐减缓。值得注意的是，在磷酸盐缓冲液中培养至40 d时，AGS2支架的结构完整性损失最大，AGS10支架的结构完整性损失最小。上述结果表明，高浓度明胶溶液更易与戊二醛发生交联反应。如图2F所示，研究发现吸水能力与明胶浓度的升高呈显著负相关（相关系数为-0.97），而打印性能与明胶浓度的升高呈显著正相关（相关系数为0.97）。同时可观察到，两条相关性曲线均呈线性，这进一步表明：随着明胶浓度的增加，支架的吸水能力下降，而生物墨水的打印性能提升。

成肌细胞生物打印与细胞培养

研究人员选取AGS5、AGS7和AGS10三种生物墨水开展进一步的成肌细胞打印研究。为评估3D生物打印支架的生物相容性，研究人员观察了支架培养7 d后的活/死细胞染色结果，并采用CCK-8法监测了第1天至第7天的细胞增殖情况。如图3A所示，所有支架均表现出优异的生物相容性，活细胞比例接近98%。尤为重要的是，与AGS10相比，AGS5和AGS7支架内的细胞分布更均匀，且这两组支架中的细胞在形态上呈现出更明显的梭形。此外，AGS7支架内的细胞数量显著多于AGS5。AGS5、AGS7和AGS10的细胞增殖曲线结果显示：AGS5与AGS10的增殖曲线（分别呈线性和抛物线形）均低于正常细胞增殖曲线，而AGS7的增殖曲线则与正常细胞增殖曲线一致；同时，第7天的细胞增殖结果表明，AGS7的细胞数量显著多于AGS5和AGS10，这进一步证实：与AGS5、AGS10相比，AGS7可促进细胞增殖。综上，AGS7支架在保持较高持水力的同时，具有更低的降解速率。这意味着AGS7既能保留更多细胞黏附位点，又能维持高效的营养物质与氧气交换，对细胞在支架内的黏附、增殖及迁移均具有积极作用。

如图3B所示，培养第1天的结果显示，AGS5和AGS7的细胞贴壁效率显著高于AGS10。且通过分析细胞倍增时间发现，AGS5和AGS7在培养第3天实现细胞倍增，并于第4天进入细胞增殖的指数生长期，这一趋势与正常细胞增殖曲线一致。与之相反，AGS10在整个细胞增殖周期内均偏离正常细胞增殖曲线，不利于后期细胞的持续培养。值得注意的是，AGS5的线性增殖曲线在第4天出现线性偏离，这表明在增殖过程中，细胞迁移与再聚集受到材料的限制。综上，通过研究不同材料比例下的细胞贴壁与增殖情况，本研究进一步阐明了在细胞持续培养过程中，AGS7在细胞贴壁、细胞迁移、细胞增殖及细胞营养物质交换方面所具备的优势。基于上述结果，研究人员选择由AG7墨水制备的支架作为后续3D组织培养所用的支架。

图3 采用不同墨水打印的各类支架及成肌细胞的生物相容性测试

3D生物打印支架的组织培养

如图4A所示，将上述制备的AG7墨水与成肌细胞混合，制备得到细胞浓度为1×10⁵ cells/mL的生物墨水，用于3D生物打印。在支架培养过程中，研究人员通过荧光显微镜（培养1～7 d）和显微镜观察（培养1～15 d），进一步分析细胞行为及增殖状态。

如图4B所示，支架内的细胞表现出良好的增殖能力：初始细胞贴壁后，先在支架边缘附近增殖。培养至第7天，细胞已完全覆盖整个支架，且分布均匀，这进一步表明该支架不仅具有良好的生物相容性，还对细胞贴壁与迁移无显著不良影响。此外，在所有时间节点的观察中，支架内均未发现明显死细胞，提示低浓度戊二醛短期交联处理对细胞状态无显著影响。

如图4C所示，对单位面积细胞数量的分析结果显示：支架内细胞在培养第3天后进入增殖指数生长期，第7天时单位面积细胞数量达到562 cells/mm²。

如图4D所示，支架内细胞在培养前7天快速增殖，这一结果与前述结论一致。值得注意的是，当细胞持续增殖至第9天时，支架内部空间被细胞填满，细胞增殖受到支架空间限制，开始向支架外部溢出。此外，细胞通过细胞间连接在支架孔隙边缘迁移并增殖：第11天时，孔隙边缘的细胞连接形成线状细胞簇；第13天时，支架孔隙边缘的细胞开始沿周边方向铺展增殖，以线状细胞簇为基础形成开放的膜状细胞组织；第15天时，支架孔隙内形成完全闭合的膜状细胞组织。

如图4E所示，在细胞培养至第9天前，支架孔隙边缘几乎未出现膜状细胞组织；第11～15天期间，膜状细胞组织的形成速度加快，其面积增幅约为75%。由此可见，支架内细胞的生长过程可分为三个阶段：早期大量增殖并迁移；中期在支架孔隙内以点状和线状形式增殖；最终在支架孔隙内完成膜状细胞组织的形成。

图4 膜状细胞组织的培养过程

2D与3D细胞培养的差异

3D生物打印完成后，支架内细胞的增殖与迁移速度加快。在支架周边区域，细胞展现出旺盛的增殖与迁移能力，最终在孔隙区域形成呈线性排列的细胞簇。这些线性排列的细胞逐渐扩张并相互连接，最终形成闭合的膜状细胞组织结构。显微镜观察进一步验证了这一过程。转录组测序分析显示，2D细胞培养与3D细胞培养存在明显差异，二者相关系数为0.374。差异基因分析表明，两种培养方式间存在3559个差异表达基因。韦恩图分析进一步揭示了2D与3D细胞培养中基因表达的重叠模式与独特模式。为深入探究2D与3D细胞培养的差异，研究人员对两类样本的数据进行分组，并对差异基因表达情况开展对比分析。利用两种培养方式的数据进行基因聚类热图分析（图5A），结果显示出不同的基因表达谱。

如图5B所示，基因本体（GO）分析结果表明，与细胞黏附、迁移、增殖及细胞组织构建相关的多种生物学过程、细胞组分及分子功能显著富集。其中，钙离子结合、细胞外基质结合、细胞表面、细胞黏附、细胞外基质结构成分及生长因子活性在这些生物学过程中发挥关键作用。在这些功能相关的差异表达基因中，显著上调的基因包括Ltbp2、Olfml2b、Fbln2、Nid2、Col3a1、Bmp4、Fgf7、Inhbb、Lama4、Csta、Gpnmb、Nfasc、Npy2r、Bmp7、Megf10、Cdh20、Clstn2、Bnc1、Dsg2等。因此，研究推测，3D打印支架材料可在细胞黏附与增殖过程中促进这些基因的表达，进而改善细胞黏附与增殖效果。富集结果中，“通过质膜黏附分子实现的同源细胞黏附”及“桥粒组装”的主要功能是：借助质膜上相同的黏附分子实现细胞附着，并促进细胞间黏附及细胞连接的形成。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析结果显示，黏着斑通路与细胞周期信号通路显著富集。

如图5C所示，黏着斑通路中富集了68个调控基因，肌动蛋白细胞骨架调控通路中富集了59个基因，细胞周期通路中富集了43个基因，紧密连接通路中富集了33个基因，细胞黏附分子通路中富集了54个基因，钙信号通路中富集了57个基因。

如图5D所示，两种培养方式间的主要差异表达基因包括Abi3bp、Cd36、Gpnmb、Apoa1、Ly6e、Csta、Rln1、Loc430862和Hps5。

如图5E所示，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）结果显示，Ltbp2、Nid2、Bmp4、Pax7、Myod和Myog基因在3D细胞培养中表达量更高。这表明，3D培养可促进关键基因的表达，从而对细胞增殖、黏附及细胞组织结构的形成产生积极影响，该结果与转录组分析结果一致。

如图5F所示，3D支架培养后期的免疫荧光结果显示，细胞已完全覆盖整个支架，且在支架孔隙内形成了具有细胞间连接的多层膜状细胞组织。

如图5G所示，将支架内细胞生长过程分为三个阶段：第一阶段为生物打印完成后细胞在支架内的附着阶段；中期为细胞在支架内的增殖阶段；后期为支架孔隙内膜状细胞组织的形成阶段。qRT-PCR结果显示，影响细胞黏附及组织形成的基因（Cdh20、Dsg2和Megf10）表达均显著增强。值得注意的是，Cdh20基因持续高表达，而Dsg2和Megf10基因仅在培养后期表达量显著升高。

PCR结果显示，在培养后期，支架内Pax7和Myod基因的表达水平显著高于早期，这也证明细胞在组织结构形成后期并未停止分裂，而是在支架孔隙内持续增殖，进而形成多层膜状细胞组织。支架培养后期Fgf7基因的高表达同样表明，此阶段细胞仍未停止增殖。

如图5H所示，蛋白质印迹结果显示，与培养早期相比，后期PAX7和MYOD蛋白的表达量显著增加。因此，培养后期PAX7和MYOD的相对高表达表明，支架内细胞的增殖行为尚未停止，同时细胞可能正在为分化及肌肉组织形成做准备，这与基因表达结果及转录组分析结果一致。综上，以卵白蛋白和明胶为主要成分的生物墨水不仅具有良好的生物相容性，还能积极调控支架内细胞中与黏附、增殖相关的关键基因的表达，并诱导膜状细胞组织的形成，表明其在培养肉细胞组织构建支架领域具有潜在应用价值。

图5 二维与三维细胞培养的差异

支架悬浮培养与贴壁培养

本研究开展了支架贴壁培养与支架悬浮培养相关实验。研究人员对两种培养方式的样本数据进行分析，并开展差异基因对比分析。

如图6A所示，基于两种培养方式的数据进行基因聚类热图分析，结果显示出不同的差异表达基因。如图6B所示，基因本体分析结果中主要富集的功能包括细胞外空间、微管马达活性、微管结合、驱动蛋白复合物及含胶原蛋白的细胞外基质。这些功能在维持细胞形态、细胞运动、细胞内物质运输及细胞黏附等多种生物学过程中发挥作用。这可能表明，悬浮培养样本在细胞外基质组成与相互作用、细胞信号传导及细胞外环境方面与贴壁培养存在显著差异。

如图6C所示，KEGG富集结果显示在黏着斑、细胞周期、甲状腺激素信号通路、范可尼等显著富集。

如图6D所示，两种培养方式间的差异基因包括Lgr5、Col9a、Map3k8、Fgf16、Nog、Cdk1、Ttk、Aaed1、Rcan2、Fancb、Fancf、Brca2等。由此可见，与支架贴壁培养相比，悬浮培养的细胞增殖周期更短，能够更早进入组织培养后期阶段，且悬浮培养的细胞可能表现出更强的分化潜能。

如图6E所示，qRT-PCR结果显示，Cdk1和Ttk基因在培养中期表达量显著升高，在后期表达量下降；而Lgr5和Map3k8基因在整个培养过程中均维持高表达。这表明，悬浮支架中的细胞在形成膜状细胞组织之前，有丝分裂活动更为活跃。后期Cdk1和Ttk基因的低表达也提示，悬浮培养可能更早进入组织培养后期阶段。因此，Wnt/MAPK信号通路活性相对较高的悬浮培养细胞，更易发生细胞分化。综上，为更好地模拟体内细胞生长环境，并尝试突破传统贴壁培养的局限性，本研究对支架悬浮培养进行了初步探索。结果表明，两种培养方式在细胞增殖、附着、运动及分化方面存在显著差异，尤其是在细胞增殖与分化方面的差异，将成为未来研究的重点方向。

图6 支架悬浮培养与贴壁培养的差异

Conclusion

综上所述，为制备适用于细胞培养肉组织的可打印生物墨水，本研究开发了以卵白蛋白和明胶为原料的新型生物墨水，并成功制备出3D打印支架，同时对支架的形态、吸水性、打印性能、降解性及生物相容性进行了表征。其中，AG7生物墨水展现出更优异的可打印性；与此同时，S型指数生长曲线进一步表明AGS7支架在细胞培养方面具有显著优势。细胞培养结果显示，成肌细胞在该支架内可实现有效的黏附、增殖与迁移。更重要的是，通过3D细胞培养，研究成功构建出类似类器官培养的肌肉细胞组织。此外，转录组学、qRT-PCR及Western blot分析结果表明，2D培养与3D培养在细胞附着、增殖及迁移过程中存在明显差异；同时发现，3D培养可促进与细胞间连接相关的基因（Cdh20、Dsg2、Megf10）的表达，进而助力细胞组织的形成。总体而言，本研究为培养肉制造提供了一种新方法的可能性，表明3D细胞培养在细胞培养肉领域具有巨大的应用潜力。

Albumen/gelatin bio-inks preparation in 3D bio-printing for in situ tissue culture of cultured meat

Xiang Guoa,b, Feng Yanga, Yu Qia, Yingying Lia, Shouwei Wanga,*, Baohua Kongb,*

a China Meat Research Center, Beijing 100068, China

b College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

*Corresponding author.

Abstract

Three-dimensional (3D) bio-printing is an emerging tissue engineering technology, and its printing parameters have been upgraded to enable in-depth application in cell-cultured meat. However, excellent printable and edible bio-inks for cell-cultured meat are in urgent need of development. Therefore, a low-cost bio-ink based on albumin and gelatin was developed. At first, suitable printability of the bio-ink was determined by rheology analysis, excellent mechanical stability, and excellent mechanical stability of the printed scaffold was also proved by water absorption and degradation rate. Next, the biocompatibility of the scaffold and its interaction with cells were clarified through cell proliferation culture, cell status research and omics analysis. Notably, AG7 demonstrated better printability and AGS7 provided better conditions for cell attachment, proliferation and migration, S-shaped exponential growth curve further revealed the significant advantages of AGS7 scaffolds in cell culture. More importantly, the tissue culture process of muscle cells was simulated to organoid culture, which elucidated the interaction information between cells and scaffolds. This work has filled the vacancy in the industry and provides a novel strategy for the development of production of cell cultured meat.

Reference:

GUO X, YANG F, QI Y, et al. Albumen/gelatin bio-inks preparation in 3D bio-printing for

in situ

翻译： 王立磊（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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