Cyanine5.5 Tyramide，花菁染料Cy5.5酪胺偶联物实验流程概述

英文名称：Cy5.5-TSA，Cyanine5.5 Tyramide，Cy5.5-Tyramide，Cyanine5.5 TSA

中文名称：花菁染料Cy5.5酪胺偶联物

分子式：C48H52CIN3O2

分子量：738.4

性状：紫色至紫红色固体

结构式：

一、基本原理

TSA 技术是一种酶促沉积信号放大方法。其核心原理是利用辣根过氧化物酶（HRP）在过氧化氢存在下，催化标记有报告分子（如荧光基团、生物素）的酪胺底物。被激活的酪胺分子在酶活性位点附近发生沉积，与富电子蛋白（如酪氨酸残基）共价、稳定地结合，从而将报告分子牢固地标记在靶标原位。Cy5.5-TSA 即是将远红外荧光染料 Cy5.5 作为报告分子引入该体系。

二、核心特性

信号放大：由于每个 HRP 分子可在短时间内催化产生大量活化酪胺分子并沉积，从而实现信号级联放大，特别适用于低丰度靶标的检测。

高信噪比：共价沉积反应高度局限在酶所在位置，扩散效应极低，可获得高空间分辨率的定位信号，有效降低背景干扰。

光谱特性：Cy5.5 是一种花菁类染料，其激发与发射波长位于远红外区域（最大激发波长约 683 nm，最大发射波长约 707 nm）。该波段受生物样本自发荧光干扰小，有利于穿透更厚的组织样本。

兼容性：TSA 技术可与多种检测平台兼容。Cy5.5-TSA 的荧光信号可使用配备相应激光器与滤光片的成像系统进行采集。此外，基于不同的报告分子，TSA 支持多重检测。

三、典型应用方向

该试剂主要用于需要对特定靶标进行高灵敏度空间定位与可视化的研究领域。

原位杂交：用于检测细胞内低拷贝数的核酸序列，提高原位杂交技术的检测灵敏度。

免疫检测：与免疫组化或免疫荧光技术联用，对组织、细胞或芯片上的蛋白质靶标进行超敏检测和可视化。

多重标记：利用不同荧光染料标记的 TSA 试剂（如 FITC-TSA, Cy3-TSA, Cy5-TSA），结合轮次检测与抗体剥离或 HRP 灭活步骤，可在同一样本上实现多个靶标的顺序标记与成像。

四、实验流程概述

典型工作流程包括：

1.样本制备与封闭。

2.一抗与靶标特异性结合。

3.使用 HRP 标记的二抗或其它 HRP 偶联物与一抗结合。4.

4.在适宜缓冲条件下，将样本与含有 Cy5.5-TSA 的工作液共同孵育。HRP 催化 Cy5.5-酪胺发生沉积反应。

5.彻底清洗，去除未结合的试剂。

6.使用适配的成像系统对 Cy5.5 荧光信号进行采集与分析。

五、注意事项

条件优化：试剂的工作浓度、孵育时间、HRP 活性及过氧化氢浓度需根据具体实验体系进行优化，以平衡信号强度与背景。

光敏感性：Cy5.5 染料及 TSA 工作液对光敏感，建议避光操作与储存。

顺序检测：在进行多重 TSA 标记时，需彻底灭活前一轮次残留的 HRP 活性，或进行有效的抗体剥离，以避免非特异性交叉反应。

样本保存：共价沉积的信号稳定性较好，但长期保存需注意荧光染料的淬灭问题。

Cy5.5-TSA 为研究人员提供了一种有效的工具，能够将远红外荧光检测的高穿透、低背景优势与 TSA 技术固有的高灵敏度、高分辨率特性相结合，满足精细定位与弱信号检出的研究需求。其有效性依赖于严谨、优化的实验方案。

以上由WWH编辑提供的实验流程等信息，仅供参考，不作为具体的实验方案、操作步骤或使用承诺。实际实验步骤与条件需由研究人员根据自身实验体系、目的及相关安全规范，独立进行设计、优化与验证。