Cardiology Plus | T7 RNA 聚合酶 II 类暂停位点对 mRNA 治疗药物的影响

从疫苗到肿瘤免疫，再到心血管疾病治疗，mRNA 药物的应用版图正在迅速扩展。然而，mRNA 药物的研发不仅依赖于蛋白质编码序列本身，更深层的“分子工艺学”问题往往决定了药物的质量和产量。

近期，Cardiology Plus 2025 年第二期发表了休斯顿卫理公会医院研究团队的一项研究，他们关注到一个可能决定最终药物的质量和产量但常被忽视的细节——T7 RNA 聚合酶暂停位点（pause site）。本研究旨在表征 T7 RNAP II 类暂停位点及其对 mRNA 生产的影响，以优化治疗性 mRNA 的设计。

什么是暂停位点？

在体外转录（IVT）中，T7 RNA 聚合酶负责把 DNA 模板“抄写”成 RNA。理想状态下，它会一直复制到末端，生成完整的 mRNA。但如果遇到某些特殊序列，它会突然“刹车”，提前终止，这些暂停位点（pause sites）会产生流产转录本（abortive transcripts）。这种流产转录物降低了 mRNA 原料药中治疗性蛋白质的产量；并可能激活先天免疫反应；和/或产生具有脱靶效应的截短蛋白。

几十年前，保守序列基序 ATCTGTT 被鉴定为内源性 T7 RNA 聚合酶 （RNAP） II 类暂停位点。但是，人们并不完全了解这个暂停位点对 IVT 过程的影响。

最新研究发现了什么？

休斯顿卫理公会医院的团队对多个 DNA 模板进行了系统研究，发现：

• ATCTGTT 可能不足以在体外诱导 T7 RNAP 转录终止。需要额外的下游核苷酸才能形成完整的 T7 RNAP II 类暂停位点：ATCTGTTtc、ATCTGTaaa、ATCTGTTta、ATCTGTTcc

• 暂停位点越靠近转录后段，影响越大，截短比例更高

• T7 RNAP 暂停位点显著影响 mRNA 制造产量。

实验亮点：突变让 mRNA “满血复活”

在一份名为“376”的序列模板中，原始版本会产生 25% 截短产物。但当研究者用同义突变替换掉 ATCTGTTt 序列后，所有截短转录本消失，产率和完整性大幅提升。

类似地，在另一份“406”序列模板中，电泳图显示没有流产峰，暂停位点的修饰让mRNA产量从1.5 mg/mL提升到7.3 mg/mL。这意味着，简单的碱基替换，就能将 mRNA 工艺效率提升近 5 倍。

图1. 对含有与不含 T7 RNA 聚合酶暂停位点的”376“模板所转录mRNA的分析

图2. 对含有与不含 T7 RNA 聚合酶暂停位点的 406 条 mRNA 的分析

免疫反应：修饰比截短更关键

研究还关注了免疫原性。在采用N1-甲基伪尿苷修饰的mRNA处理后，不同模板的细胞因子释放（如 IL-6）差异不大。这说明：

• 暂停位点确实影响产量和纯度；

• 但免疫原性主要由化学修饰决定，而非截短片段的多少。

图5. nGFP mRNA的免疫原性

未来展望：mRNA 药物设计的规则

这项研究给 mRNA 药物研发带来了几个重要启示：

1. DNA 模板设计要避开暂停序列

在设计开放阅读框时，应仔细检查是否包含 ATCTGTT 及其变体。

2. 暂停效应与位置相关

越靠近 3’ 端，越容易生成截短产物。设计时不仅要看序列，还要看“地理位置”。

3. 优化产量与质量的低成本策略

同义突变是一种高效而安全的手段，可避免截短产物而不改变蛋白序列。

4. 未来方向：酶学改造

部分改良型 T7 RNAP（如 K179C/M750C 突变体）能够绕过暂停位点。这为工艺开发提供了另一种思路。

结语

随着 mRNA 技术走出疫苗赛道，向心血管、代谢性疾病等慢病领域延伸，生产工艺的“隐形障碍”不容忽视。T7 RNA 聚合酶暂停位点，就像隐藏在 DNA 序列里的“暗礁”，一旦触发，可能让整个生产过程效率大打折扣。

这项研究提醒我们：mRNA 药物设计不仅是生物学问题，更是工程学问题。

在序列优化、化学修饰与酶学改造的共同作用下，未来的 mRNA 药物将更加安全、高效，为临床治疗带来更多可能。

引用本文：Li, Linda Hongye1; Wang, Xiaoxiao1; Yan, Qing1; Gateway, Celetta G.1; Van Meter, Bennett1; Damase, Tulsi1; Liang, Yi1; Morales, Elisa1; Domingues Bueno, Murilo T.1; McRae, Ewan K.S.1; Cooke, John P.1,*. The impact of T7 RNA polymerase class II pause sites on mRNA therapeutics. Cardiology Plus 10(2):p 99-109, April-June 2025.

DOI: 10.1097/CP9.0000000000000123

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