纳美信开发非RNase R依赖的环状RNA纯化方法

2025 年 2 月，纳美信完成数千万元的 A 轮融资，融资资金将主要用于推进 NR222 项目的临床研究以及新项目的研发。NR222 项目是国内首个获批临床的冻干剂型 RSV mRNA 疫苗，成功实现了 2-8℃长期保存。目前，公司已取得超过 18 个月的稳定性数据，且各项指标保持良好，预计效期大于 36 个月。纳美信自创立之初就拥有明确的目标—要做世界上最一流的 RSV mRNA 疫苗，不盲目追逐热点，始终聚焦 RSV mRNA 疫苗的开发。

本期内容，我们介绍纳美信开发的一种简单快速的环状 RNA 纯化方法，无需 RNase R 处理，只需通过 oligo DT 亲和层析便可快速获得高纯度环状 RNA。

在经典的 PIE-Ana 线性前体序列和环化后的序列中，均存在 PolyAC 间隔区，无法通过 oligo DT 亲和层析区分线性前体和环状 RNA。常用的纯化方式是 RNase R 消化线性前体，再利用 SEC-HPLC 分离得到环状 RNA。然而，RNase R 特异性不是很好，酶切时间过短或者浓度过低，会造成线性前体未完全降解；酶切时间过长或者浓度过高，会导致部分环状 RNA 也会被消化。

首次解决circRNA大规模纯化：PolyA聚合酶与亲和层析结合，我们介绍过利用 oligo DT 亲和层析纯化环状 RNA 的两种方式：一种是环状 RNA 流穿模式，另外一种是环状 RNA 梯度洗脱模式。

郑州大学基础医学院梅英武团队选择了梯度洗脱模式：利用 poly(A)聚合酶给基于 I 型内含子合成的 circRNA 合成产物中所有线性 RNA-3'OH 末端添加一段超过 200nt 的 poly(A)尾巴，然后，通过 oligo (dT)亲和层析将这些加尾线性 RNA 与 circRNA 分离。带有较长 poly(A) 尾的线性 RNA 杂质在 oligo (dT)柱上表现出更长的保留时间，而具有较短 poly(AC)间隔序列的 circRNA 洗脱速度更快，从而将线性前体与环状 RNA 分离开来。

纳美信则选择了另外一种环状 RNA 流穿模式：替换掉环化区域的 PolyAC，使得环状 RNA 无法结合到 oligo DT 亲和层析柱上面。在经典 PIE-Ana 线性前体序列中存在5'/3'两段 PolyAC 间隔序列，目的是避免 IRES 复杂的二级结构干扰剪接反应的发生。成环之后，5'/3'两段 PolyAC 间隔序列会残留在环状 RNA 序列上面。2022 年，斯坦福大学张元豪团队在 Nature Biotechnology 期刊发表过一篇文章：Engineering circular RNA for enhanced protein production ，他们发现使用5'/3' UTR 序列替换掉间隔序列 PolyAC，可增强环状 RNA 的表达水平。基于此，纳美信研发团队选择用Apt-eIF4G5' UTR序列和HBA1Full 3' UTR 替换掉经典 PIE-Ana 线性前体序列中的间隔序列 PolyAC，从而使得环状 RNA 序列不再具有 PolyAC，无法结合到 oligo DT 亲和层析柱上面。同时，他们在线性前体 5'末端添加一段 PolyA 序列，使得线性前体可结合到 oligo DT 亲和层析柱上。这样的话，利用 oligo DT 亲和层析便可将线性前体和环状 RNA 分离开来，无须借助 RNase R。

延长 IVT 反应时间，提升环化效率

由于 IVT 反应缓冲液中含有 GTP 和镁离子，因此，在 IVT 反应过程中，转录和环化可同时发生。纳美信研究人员探索制备 circGFP 的工艺条件，毛细管电泳峰图显示，在 37℃ IVT 反应 3h 的纯化产物（氯化锂沉淀）中，线性前体 RNA 占比为 57.2%，环状 RNA 占比为 28.9%，环化效率为 33.6%；在 37℃ IVT 反应过夜（16h）的纯化产物中，线性前体 RNA 占比23.7%，环状 RNA 占比为 46.4%，环化效率为 66.2%。也就是说，即便不采取额外的环化步骤（55℃+10mM 镁离子+2mM GTP），只是延长 IVT 反应时间，也能显著提升环化效率。

oligo DT 亲和层析纯化环状 RNA

由于前体 RNA 和剪接副产物含有 poly(A) ,而环状 RNA 不含 poly(A) ,故可通过 oligo dT 亲和层析去除含 poly(A)的杂质,从而在流穿中回收得到不含 poly(A)的环状 RNA。oligo 亲和层析平衡缓冲液成分为：50mM Tris，250mM NaCl。将待纯化样品加载至亲和层析柱，在后平衡阶段收集流穿组分，即为环状 RNA 组分。最后，用超纯水冲洗柱子，洗脱结合组分并收集，即为洗脱杂质。毛细管电泳显示，oligo DT 纯化前样品中的环状 RNA 占比为 46%，经过 oligo DT 亲和纯化后，环状 RNA 占比提升至 83%。洗脱杂质主要成为线性前体 RNA 和剪接副产物。

PolyA 长度和位置对于环状 RNA 纯化效果的影响

研究者还将不同长度的 PolyA 添加至线性前体的 5'端或者 3'端，探索其对 oligo DT 纯化效果的影响。PolyA 长度和位置并不会对环化效率产生影响，在纯化前，所有前体 RNA 占比为 20%左右，环状 RNA 占比为 70%左右。当 poly(A)长度大于 15 个 A 且添加在 5'端和/或 3'端时,通过 oligo dT 亲和层析纯化可明显提高环状 RNA 的占比 (大于 60%) ,降低前体 RNA 的占比 (小于 10%) ,环化率提 高到 85%以上。其中5'端添加大于 30 个 A 的 poly(A) ,纯化效果最明显,纯化后环状 RNA 的占比大于 80% ,几乎所有前体 RNA 均可通过 oligo dT 纯化去除。

小结

纳美信通过改造经典 Ana-PIE 前体序列，使用 UTR 替换掉间隔序列 PolyAC，在前体 5’末端添加 PolyA，使得采用 oligo DT 亲和层析便可区分线性前体与环状 RNA。然而，在纳美信的专利中，还存在一些问题，并未阐述清楚：

第一，毛细管凝胶电泳只能区分线性前体和 circRNA/Nicked RNA，无法将 circRNA 与 Nicked RNA 区分开来。纳美信专利中只采用毛线管凝胶电泳分析了纯化产物，我们无从得知纯化获得的环状 RNA 中 Nikced RNA 占比为多少。

第二，纳美信专利中只检测了环化前产物和纯化后环状 RNA 细胞水平的蛋白表达，并未比较其与线性 mRNA 的表达水平差异，并未展示环状 RNA 表达水平随时间变化的动力学特征，并未更进一步分析其在体内的表达情况是否要优于线性 mRNA。

纳美信环状 RNA 质粒序列注释

参考文献

1. 一种环状RNA的制备和其专用载体及应用，申请公布号CN 118667805 A.

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