地高辛（DIG）标记原位杂交实验指南

原位杂交实验中，地高辛标记探针一直以来都是研究者使用最为广泛的一类工具探针。地高辛源于一种从洋地黄类植物中提取的类固醇物质 --- Digoxigenin（DIG）。由于Digoxigenin在自然界中来源单一，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。相较于传统的放射性标记和生物素标记，地高辛标记和检测系统具有安全稳定、高灵敏度、高特异性且背景极低的显著优势。

然而，从探针标记方法到检测体系的选择，每一步都关乎实验的成败。为帮助研究者规避常见陷阱，本文旨在提供一份简明的选择指南，系统梳理从地高辛标记方法、地高辛标记探针的原位杂交实验到检测策略的关键要点及选择，助力大家提升实验效率与成功率。

一、地高辛标记方法的选择

目前，地高辛标记主要应用在制备DNA探针上，常用的标记方法有随机引物法和PCR法。

随机引物法是利用随机序列的寡核苷酸（通常为6-8个碱基）作为引物，在DNA聚合酶（如Klenow片段）的催化下，以变性的双链DNA为模板，合成新的DNA链。在反应体系中加入地高辛标记的dUTP，从而将DIG掺入到新合成的探针中。该种方法具有优异的标记效率，标记的探针长度也相对均一，但其标记的是整个模板，如果模板中含有重复序列或载体序列，可能会增加非特异性杂交背景。同时也比较依赖模板量和纯度，需要微克级的纯化DNA作为起始材料，代表性产品主要为Roche的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 和II。

PCR法是在常规PCR反应体系中，加入一定比例的地高辛标记的dUTP，通过特异性引物扩增目标片段，从而将DIG直接掺入到PCR产物中。相较于随机引物法，该种方法对模板的量和纯度要求极低，当只能获得有限量模板，或模板仅仅部分纯化，或模板非常短时，PCR标记是制备DIG标记探针的优选方法，即使是粗提的DNA也能作为模板。但有一点，PCR法需注意反应条件以及Dig-dUTP与未标记核苷酸的比例优化，以平衡扩增效率与标记效率，比例过高或会抑制PCR扩增。研究者可以选择像BIOG这类已经充分优化好反应体系的地高辛标记试剂盒，可以省去摸索条件的时间成本，并且制备出来的探针灵敏度要高出随机引物法50~100倍。另外，该试剂盒里的超级热启动酶，加上特异性引物可最大程度降低非特异性标记，这一点也要优于随机引物法。

二、原位杂交试剂盒的选择

有了地高辛标记探针以后，下面就是最为重要的原位杂交实验环节。研究者可以自行查找和配制各类工作液来进行实验，但这比较考验研究者自身的经验和实验方法的可靠性。选择原位杂交试剂盒将更为靠谱，它不仅仅是一个简单的试剂集合，更是一个经过优化的标准化系统。像市面上常用的Roche、BIOG、Thermo Fisher等品牌都有性能稳定的原位杂交试剂盒可供客户选择。

值得注意的是，在实验过程中，通透和杂交步骤都十分关键，研究者可重点关注每家试剂盒中的通透工作液和杂交工作液，不同厂家的配方和技术具有一定差异。如百代生物的通透工作液特别添加了通透因子，不仅能帮助在细胞膜上进行高效打孔，使探针更容易进入，而且还可有效避免对胞浆胞核造成损坏，大大提高原位杂交实验的成功率。而杂交工作液是能决定杂交结果好坏的最关键成分。其作用是创造一个最优化的化学环境，确保探针能够高效、特异性地与它的靶核酸（DNA或RNA）结合，同时最大限度地减少非特异性结合，罗氏、百代这几家的杂交液都比较不错，不仅能促进特异性杂交，充分封闭组织细胞中探针的非特异结合位点，还特别添加了稳定剂成分，能将探针分子“困”在局部区域，有效增加探针的相对浓度，从而大大加速杂交反应速率，更能使杂交体保持稳定。

三、地高辛标记检测方法的选择

地高辛标记探针的检测主要依赖于抗地高辛抗体和抗体上所标记的酶（如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶）。其原理是利用免疫酶促反应来进行检测，巧妙地利用了半抗原-抗体反应的高特异性和酶催化反应的高灵敏度。抗地高辛抗体建议大家尽量选择进口的，其效价相比于国内的会更高，性能更加稳定，上述几家品牌都有采用进口抗体制备的地高辛标记检测试剂盒，研究者可根据实验经费自由选择。

由于偶联在抗地高辛抗体上的酶类型不一样，一般常用的有两种检测体系：

·Dig –HRP（辣根过氧化物酶）检测体系：以DAB（四氢氯化二氨基联苯胺）/H2O2为底物，结果为棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2O2为底物，结果为蓝色。

·Dig –AKP（碱性磷酸酶）检测体系：以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。

但同样是酶促显色反应，AKP灵敏度和分辨率较HRP高出约10倍左右，非常适合于原位杂交实验结果的检测，可在显微镜下直接观察到探针杂交分布的情况。以BIOG地高辛标记探针原位杂交检测小鼠肝脏组织汉坦病毒感染为例（图1），以碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，与组织细胞中通过原位杂交定位结合的地高辛标记探针高效结合，再通过NBT/BCIP显色，即可灵敏准确地展示出所要检测的靶基因及其细胞定位，可广泛用于组织原位杂交、细胞原位杂交和染色体原位杂交等。

图1地高辛标记探针原位杂交检测小鼠肝脏组织汉坦病毒感染.