元码智药开发基于RNA茎环结构的通用型无痕环化策略

近期，元码智药（Byterna Therapeutics）宣布完成数千万元人民币天使轮融资，资金将用于环状 mRNA体内 CAR-T管线的临床前开发与 IIT 临床研究。元码是一家非常新的环状 RNA 公司，成立于 2023 年，此前，业界关于元码的消息极少。今年年中，我们查找关于环化技术的专利文献时，意外发现了国内还存在这么一家在环化技术上别出心裁的初创。近期，我们打算做一个关于元码环化策略的系列报道，本期首先对元码开发的基于茎环结构的环化策略做整体性的概述，后续将深入剖析序列设计，感兴趣的朋友可持续关注。

关于环状 RNA 环化策略的文章，我们已经分享过很多，在这里，我们也就不再对 PIE 的原理做过多解释。在经典 Ana-PIE 环状 RNA 前体设计中，通常，将剪接位点（3'SS 或者 5'SS）设计在待环化目的序列 5'末端和 3'末端。然而，这样子做有一个很大的弊端，环化后的 circRNA 序列中存在额外的序列：E2/E1+Internal Homology +PolyAC Spacer，可能触发天然免疫反应。如果删除掉 Internal Homology +PolyAC Spacer，经典 Ana-PIE 环状 RNA 前体的环化效率又会变得极低。

元码研发团队将目光看向 Ana-tRNA-Leu 的二级结构，如同所有的 tRNA 一样，其拥有典型的三叶草结构，即 3 个茎环结构。在 Ana-pre-tRNA-Leu 编码基因序列中存在一段拥有自剪接功能的Ⅰ型内含子序列（249bp），有意思的是，AnaⅠ型内含子序列的自剪接位点位于反密码子环中（碱基 34 与 35 之间）。据我们推测，正是受此启发，元码智药研发团队有了关于环化策略的新想法：根据待环化 RNA 序列的二级结构，找到类似的三叶草结构元件，将核酶剪接位点置于其茎环结构中，再与 Ana-PIE 核酶 3'/5' Intron 组合成环状 RNA 前体，是否能够成功环化目标 RNA 序列呢？幸运的是，他们成功了，开发出了一种基于待环化 RNA 序列内部二级结构的通用型无痕环化策略。

从 5'端到 3‘端，元码开发的环状 RNA 前体依次可分为三大模块：模块 Z1、待环化模块 L、模块 Z2。模块 Z1 为同源臂+经典Ana-3'Intron 切片，模块 Z2 为经典Ana-5'Intron 切片+同源臂，模块 Z1 与模块 Z2 组合形成具有自剪接功能的核酶。与经典的 Ana-PIE 环化策略相比，在元码前体 RNA 序列中，Ana pre-tRNA-Leu 基因Ⅰ型内含子序列一分为二断裂为 5'Intron 切片和 3‘ Intron 切片的位置是相同的。待环化模块 L 环化形成环状 RNA，其剪接位点位于成环后的环化 RNA 二级结构内的茎环结构（stem-loop structure）的端环区（distal loop region）。这种茎环结构可分为两种类型，一种是类似于三叶草结构的多茎环结构，称为TLSL结构元件，拥有 2-5 个端环区；另外一种是单茎环结构，称为SL结构元件，由茎区以及茎区远端的端环区构成。为形成稳定的 P1 结构，需对 Ana pre‑tRNA‑Leu 基因内含子在 5'端第 10 位和第 11 位做出突变，以使其与待环化 RNA3’末端碱基互补。元码将基于内源性的多茎环二级结构TLSL的 PIE 环化系统，称为 Hi-scarless-PIE；将基于内源性的单茎环二级结构SL的PIE 环化系统，称为 Uni-cRNA。

元码环化策略的关键在于找到待环化 RNA 序列二级结构中合适的 TLSL 结构模块或者 SL 结构模块。TLSL 结构模块由一个多臂连结（multi-arm junction）和多个端环(distal loop)相连组成，其中，多臂连接的一个臂为末端臂，末端臂不连接端环，其余各臂分别与一个端环形成封闭连接，形成仅在末端臂上有暴露的 5'和 3‘端的多端环连续结构。此外，多臂连接的臂可能包含凸环（bluge）和内环（internal loop），多臂连接的连接处可包含多环（multiloop）。SL 结构元件指目标环状 RNA 分子二级结构中含有的单茎环，由一个茎区或者称臂和一个端环相连接而成，茎区可包含凸环和/或内环。TLSL 结构模块或者 SL 结构模块可位于 IRES 序列内部，也可位于 CDS 序列内部。TLSL 结构模块可以是 IRES 序列内天然存在的，也可以插入外源预设的 TLSL 结构模块。

元码环化策略的优势有两点：

第一，通用性，环化效率不受待环化 RNA 序列的影响。经典 Ana-PIE 环化策略虽然操作起来简单，但是，对于待环化 RNA 序列的兼容性不是很强，有些目的 RNA 序列环化效率很高，有些目的 RNA 序列环化效率很低。元码环化策略构建的环状 RNA 前体核心在于将剪接位点置于待环化 RNA 二级结构的茎环结构上。茎环结构广泛存在于各种类型的 RNA 分子(IRES、CDS、UTR、非编码 RNA 序列)中，尤其是单茎环结构的分布更广。理论上来说，元码环化策略可以环化包含 TLSL/SL 结构模块的 RNA 任何 RNA 序列。即便不含有 TLSL 结构模块，在 IRES 序列中插入预设的 TLSL 模块，也可以高效环化任意 mRNA 序列。

第二，无痕环状 RNA。与经典的 Ana-PIE 环化 RNA 前体相比，依据茎环结构设计的 Ana-PIE 环化 RNA 前体序列中并不存在 PolyAC SPacer 和内源性同源臂。在环状 RNA 的终产物中，不引入任何额外序列，待环化的线性 RNA 序列与生成的环状 RNA 序列完全一致，杜绝了额外的外源序列可能引发天然免疫的风险。

第三，环化效率高。基于单茎环结构的 Uni-cRNA 环化效率可达约 80%或更高，而基于多茎环结构的 Hi-scareless-PIE 环化效率为 90-95%或者更高。

参考文献

1. 一种通用的制备环状RNA的方法及其用途，申请公布号119662636 A.

识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入

生物制品微信群！

请注明：姓名+研究方向！

本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。