安全药理学研究伴随一般毒理试验开展的可行性、挑战、具体评价方法及181个案例

将安全药理学终点纳入重复给药毒理研究中符合动物“3R”原则，也节约研究成本。那么这种合并研究需要注意哪些细节呢？围绕这个话题略作讨论。

重复给药毒理研究中纳入安全药理学终点可以从科学和法规两个层面分析。

首先是科学层面。早在20世纪70年代末，由Gerhard Zbinden领导的毒理学先驱们就开始呼吁在毒性研究中纳入安全药理学终点，随后这一观点得到了业内同行的呼应。将安全药理学终点纳入重复给药毒性研究的科学依据主要基于以下几点：

1）延迟效应现象：单独的安全药理学研究通常为单次给药。如果仅评估单次给药的效应，可能会遗漏延迟出现的效应。例如胺碘酮对QT间期的延迟性、进行性影响，通常在心肌中积累数天甚至数周后才显现。又如用于治疗冠心病、糖尿病、肥胖症、关节炎、注意力缺陷多动障碍和精神障碍的药物可能会增加心血管不良事件的发生率或心血管风险因素。这些风险通常是在长期治疗后才显现的。

2）功能变化与病理变化的关系：一些功能变化可能先于病理损伤出现，或者在较低暴露水平下发生，因此可以作为临床可转化的生物标志物，用于指导和限制临床试验中的剂量递增。另外，一些病理变化是功能变化的结果，如由于药物诱导的持续心动过速和/或低血压，导致犬和猴出现特定的心脏病变。合并研究可以在同一个体系中考察功能变化和病理变化的关系。

再看下法规层面。

1）1997年ICH S6关于生物制品的临床前安全性评价指南颁布，指出安全药理学试验用于检测潜在毒性的功能性指标，这些功能性指标可以通过单独的试验也可以结合在毒性试验中考察。

2）FDA关于探索性新药IND研究的指南也鼓励将安全药理学终点纳入毒性研究（Guidance for Industry, Investigators, and Reviewers Exploratory IND Studies,2006），从而减少了单独开展安全性药理学研究的必要性。

3）2009年修订后的ICH指导文件（S9）关于肿瘤药物非临床评价的指南也基本取消了对单独安全性药理学研究的法规要求，心血管、呼吸和中枢神经系统这些参数可纳入到一般毒理学试验中。在非啮齿类动物中进行了给药后的详细临床症状观察及合适的心电图检查，通常认为已经足够。

4）此外，某些专门的法规要求还包括纳入特定的行为测量，如ICH S5(R2): detection of toxicity to reproduction for medicinal products and toxicity to male fertility和Guideline on the need for non-clinical testing in juvenile animals of pharmaceuticals for paediatric indication(EMA, 2008)。这些出生后发育的法规指南要求对在妊娠期间暴露于受试物的F1代进行行为测试，以及幼龄动物毒理研究中，对新生和/或幼年动物进行给药，需使用行为测试进行评估。行为测试包括功能性观察组合（FOB）、运动活动、运动协调（例如旋转杆）和学习与记忆测试。因此，如果以上行为学评估可以纳入这些专门的研究中，那么原则上也可以将其纳入一般毒理研究中。

安全药理终点纳入一般毒理研究面临的挑战

虽然无论科学层面还是法规层面，都有将安全药理学终点纳入一般毒理研究的支持性证据。但这一合并研究也存在一些客观挑战。

重复给药毒性研究的目的是让动物在较长时间内暴露于不同剂量的受试物，评估全身毒性指标，并最终在尸检后评估组织病理学变化。任何额外的安全药理学测量都不应且不能干扰这些目标。然而，研究设计、实验室设计和环境可能并不适合获取高质量的安全药理学数据。下图中，图1a是为安全药理学研究专门设计的啮齿动物实验室，图1b则是典型的啮齿动物毒理研究饲养室（及准备室），黄色区域是进行功能测试的场所，比较直观展现了实验室设计差异可能引入的挑战。

将安全药理学评估整合到一般毒理研究中需要一定的妥协和调整。例如，根据研究类型和功能测量的需求，可能需要错开开始日期，例如连续两天分散进行，以便对主研究组的所有动物进行测量，或者在安全药理学评估当天错开给药时间，以便在药物浓度达到最大值（Tmax）的时间点进行测量。

还有一个挑战来自重复给药的药物耐受性。重复给药毒性研究的第一天通常是工作人员最繁忙的一天；当天已经安排了在特定时间点进行TK采样，而且操作室相对拥挤，有参与毒性研究的技术人员、课题负责人、质量保证人员甚至委托方人员。其实并不是一个适合安静且仔细测量生理和行为参数的时间点。但如果选择在第2天进行测量，可能会错过首次给药的峰值效应，而这一效应可能在第二次给药时已经减弱或完全改变。但如果第1天受试物出现一定程度的不良反应，就不得不在第2天进行安全药理数据收集，算是一种权衡。所以，一般安全性比较好的候选药物，比如某些单抗或者多肽，比较适合安全药理伴随一般毒理开展。这里要注意下，如果不单独开展安全药理研究，而是将其并入重复给药毒理，属于后者替代前者。对于这种情况，药物耐受性的挑战是要重视的，需最大可能保障安全药理数据的高质量获取。但如果单独开展安全药理研究，同时重复给药加设安全药理终点，属于后者是前者的补充，要求就灵活很多，不太需要对毒理设计进行太多调整。

除了以上，安全药理学研究和一般毒理研究在细节方面还有很多区别，如下表所示。

合适的安全药理评价方法

在重复给药毒性研究中用于评估安全药理学终点，除了来自研究设计、实验室设计和环境的挑战，安全药理参数收集的方法也很关键，理想情况下应是非侵入性的、不会引起应激、不需要麻醉且不需要限制进食。否则，应考虑设置卫星组，甚至单独开展研究。设备需要便于携带且相对小巧：理想情况下，应将设备移动到动物饲养处，而不是将动物转移到设备处。或者，设备可以是设施的一部分，并专门用于测量（如非侵入性遥测接收器）。测量应由熟悉如何获取高质量安全药理学数据的科学家和技术人员进行，并且他们应具备收集、分析和解释数据的能力。下表列出了适用于重复给药毒性研究主试验动物的安全药理相关指标收集方法示例，主要包括心血管系统、神经系统和呼吸系统。

特定器官功能的应用

安全性药理学评估的五个器官功能包括心血管系统、神经系统、呼吸系统、胃肠道系统和泌尿系统。除此之外，有时还会增加全身代谢功能的评估。

心血管系统

ECG间期和形态

近年来，市场上出现了适用于犬和非人灵长类动物的马夹式的非侵入式、便携式遥测系统。这些系统能够在动物的自然环境中，对清醒或睡眠状态下的自由活动动物进行至少24小时的连续II导联心电图记录。这种遥测系统获得的数据质量优于传统“快照式”记录方法获得的数据质量，包括实现更低的静息心率，并且数据量更多。这种方法能够确定效应的起始时间、持续时间、强度和可逆性，以及剂量依赖性和PK-PD关系。将QT间期与RR间期作图可以避免QT校正因子带来的不准确问题，并能揭示药物在不同心率水平下的诱导变化。

与检测QT间期效应不同，在自然发生的心率升高期间进行采样有助于检测钠通道阻断剂引起的QRS间期延长。与hERG钾通道阻断不同，钠通道阻断是心率依赖的。与快照式心电图相比，24小时采样期间检测到心律失常的可能性更大，同时也能检测到研究前已存在的波形异常。另外，与植入式遥测设备的单次给药安全药理学研究相结合时，非侵入式心电图测量有时可以揭示在重复给药时加剧的效应。

左心室功能

在未麻醉的犬中使用超声心动图是一种成熟的技术。可以通过超声心动图在未经镇静、预先训练、绑定（或侧卧位）的犬以及小型猪中监测左心室功能。超声心动图也可以用于食蟹猴，但需要镇静或麻醉。在比格犬中，通过超声心动图得出的左心室射血分数（LVEF）与通过植入式遥测设备在同一批动物中测量的左心室最大压力变化率（dP/dtmax）之间观察到良好的一致性。此外，QA间期（心电图的Q波与主动脉压力波上升的时间间隔）也可以用作心室收缩力的指标。

动脉血压

在啮齿类动物中，非侵入性血压测量方法采用尾袖法。然而，这种方法只能可靠测量收缩压和心率，并且需要预热和约束才能获得测量值。即使在研究前适应了这些记录条件，所获得的收缩压和心率值仍高于未约束且植入遥测设备的动物。鉴于法规要求重复给药毒性研究在两种动物中进行，在较大的非啮齿动物中进行心血管评估更为合理。尾袖血压测量法本身在犬中也有很好的应用，而最近引入的高分辨率振荡法（HDO）能够捕捉血压波形，并准确测量收缩压、舒张压和平均动脉压。HDO也已用于食蟹猴。

对于犬，有可供使用的便携式尾袖法，结合非侵入性遥测技术在同一动物中同时测量心电图和血压。另一种方法是通过连接到微型遥测发射器的动脉导管，在犬或食蟹猴中进行最小侵入性血压测量。

神经系统

全面神经行为学评估

由于神经系统功能的极端多样性和复杂性，无法设计出一种方便的体内评估方法来涵盖所有功能。因此，在安全性药理学中，首先使用的是神经行为学评估，形式可以是功能性观察组合（FOB）或Irwin试验。

自动化活动分析

啮齿类动物的活动可以通过两种方式评估：笼内活动或在新环境中活动（自发运动活动）。这两种测量方法有很大不同。后者涉及探索动机与在不熟悉环境中焦虑增加之间的冲突。可以使用光栅阵列或视频跟踪来监测。在新环境中，动物的活动和直立行为最初很高，随着动物探索和适应环境，大约30分钟后逐渐减弱，最终大部分时间处于静止或梳理毛发状态。笼内活动则没有冲突或适应性成分。

目前，正在出现一种新技术，用于在群居饲养的啮齿动物的笼内测量个体的活动、行为和体温，而无需外科植入遥测发射器。可以使用植入皮下的射频识别微芯片应答器（“RFID芯片”）通过放置在笼子下方的基板阅读器检测，来测量群居饲养啮齿动物的笼内活动；这种方法还可以结合测量活动和体温。同样，也可以通过这种方式监测群居饲养啮齿动物的个体食物和水分摄入量。

犬和猴的活动可以通过在它们项圈中的加速度计或作为非侵入性遥测系统的一部分来测量。使用不同颜色的外套可以实现对群居饲养的食蟹猴进行定量视频跟踪。

其它神经行为系统指标还包括视觉功能、瞳孔、唾液分泌、肌肉功能等，在上表中已作介绍。

呼吸系统

可以从啮齿动物（通常是大鼠）中轻松获取呼吸参数，使用全身描记术是一种非侵入性、无需约束的方法，通过测量因吸气和呼气导致的腔室压力变化来实现。使用全身描记术的独立安全药理学研究通常在给药前需要60-90分钟的稳定期，以确保稳定的呼吸信号，并减少因活动、嗅探、梳理毛发或直立行为导致的信号干扰。给药后记录通常持续长达6小时。该技术必须采用适当的温度和湿度补偿，以确保准确测定潮气量。将这种技术应用于重复给药毒理研究是可行的。

可以使用非约束、带马夹的遥测方法在犬中测量呼吸参数。这种技术称为呼吸感应描记术，涉及在胸腔和腹部放置柔性带，能够连续测量长达24小时的呼吸参数。这种非侵入性遥测技术还可以同时测量心血管参数，并且同样可以用于非人灵长类动物。

其它如胃肠道系统、泌尿系统、代谢功能等，用的较少，后续有机会再分享吧。

案例分享一（144款、单抗、多抗、ADC）

笔者回顾性分析了已上市的144款单抗、多抗及ADC类药物，一起看下这些产品在实际申报过程中，安全药理学研究是单独开展还是伴随一般毒理开展，还是单独+伴随组合的形式。

144款药物中，单抗、双抗、ADC的数量分别是118、16和10款。

118款单抗中，78款药物的安全药理学研究伴随一般毒理研究开展，12款单独开展，5款药物是单独+伴随一般毒理相组合的形式，即部分试验单独开展如神经系统安全药理，部分安全药理终点则伴随在一般毒理研究中。这其中，还有21款药物未开展安全药理学研究。未开展安全药理研究的多是生物类似药，占15款。其它不开展安全药理学研究的原因主要是没有合适的相关动物种属，如Daratumumab、Elotuzumab、Spesolimab。

16款双抗中，13款安全药理学研究伴随一般毒理研究进行，2款选择了单独开展，1款未开展。未开展安全药理学研究的这款双抗是Tebentafusp，这款蛋白不与动物靶点结合，所以非临床毒理研究仅开展的体外评价（Tebentafusp can only recognize human HLA; therefore, all nonclinical toxicology studies were conducted in vitro. Therefore, no specific safety pharmacology studies were conducted）。

10款ADC药物，6款选择伴随重复给药毒理研究开展，4款单独开展了安全药理学研究。当然，hERG试验属于体外研究，不计入内。

所以，很明显，大部分生物药物安全药理学研究是以伴随一般毒理研究开展的形式为主，而且是心血管、呼吸系统、中枢神经系统的终点均纳入一般毒理试验中考察。

案例分享二（37款化药）

以2023年FDA批准上市的37款新分子实体药物作为案例，分析下化药安全药理研究通常单独开展还是伴随一般毒理研究试验开展。如下表所示，罗列了产品的商品名、通用名、获批上市时间、开展形式和研究内容示例。

37款化药中，25款选择了单独开展的形式。6款采用的单独开展和伴随开展相结合的形式，其中2款选择大鼠CNS和呼吸伴随大鼠重复给药毒理开展，2款仅大鼠呼系统安全药理伴随一般毒理开展。

3款则选择全部安全药理研究终点伴随一般毒理试验开展。QALSODY采用所有安全药理研究终点伴随一般毒理试验开展，可能原因与本品为鞘内注射，治疗SOD1 基因突变的渐冻症这一罕见病有关。MIEBO则仅在大鼠MTD中伴随了CNS研究，未开展其它安全药理学研究，可能与本品为滴眼液，系统暴露有限，或可能其它剂型考察过安全药理终点，感兴趣的可以进一步求证。AUGTYRO心血管安全药理研究伴随食蟹猴一般毒理，可能与本品为抗肿瘤药，适用ICH S9有关。

POSLUMA未开展安全药理学研究，因本品为微剂量放射性物质。

总而言之，大部分化药还是以安全药理研究单独开展的形式进行。再不济也是以单独开展为主，伴随开展为辅，把相对没那么重要的呼吸系统安全药理研究摘出去，放到一般毒理试验中。

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