清华大学张洪杰院士、刘凯教授AM：时序免疫调节水凝胶为感染性骨缺损再生提供新策略

感染性骨缺损是骨科治疗中的难题，常伴随病原体感染、免疫微环境紊乱及骨再生障碍。当前临床手段如清创手术和长期抗生素治疗虽能暂时控制感染，却难以恢复免疫稳态或营造促再生微环境；而传统骨修复材料虽支持结构重建，却缺乏清除病原体和调控免疫的功能。这种治疗策略上的局限常导致慢性炎症、感染复发和骨再生失败。近年来，骨免疫学研究强调免疫调节在骨愈合中的核心作用，尤其是巨噬细胞表型时序转换对感染控制与组织再生的双重调控，为开发新型免疫调节型生物材料提供了重要方向。

清华大学张洪杰院士、刘凯教授、万思康博士和中国科学院长春应用化学研究所刘雅薇副研究员、华东师范大学孙静研究员联合研发出一种时序免疫调节水凝胶（TIH），通过时序释放Ca²⁺和Zn²⁺离子，精准调控巨噬细胞从M1向M2表型转变，从而实现感染控制与骨再生的协同促进。该水凝胶由丙烯酸酯修饰的工程化蛋白与氧化海藻酸钠通过Schiff碱和光交联反应快速形成，模拟细胞外基质结构，支持细胞黏附、血管生成和成骨分化。嵌入的锌/钙磷杂化纳米颗粒可实现Ca²⁺的早期爆发释放以激活M1巨噬细胞清除病原体，以及Zn²⁺的持续释放以诱导M2极化促进成骨。该系统还具备抗氧化和抗菌性能，在大鼠感染性颅骨缺损模型中表现出显著的骨再生能力。相关论文以“ Temporal Immunomodulatory Hydrogel Regulating the Immune-Osteogenic Cascade for Infected Bone Defects Regeneration ”为题，发表在Advanced Materials上，论文第一作者为Jin Chaonan。

示意图1. TIH的设计与功能示意图 TIH制备过程示意图。该水凝胶通过时序释放Ca²⁺/Zn²⁺离子调控免疫-成骨微环境，并具备抗菌、抗氧化和促血管生成性能，进一步促进感染性骨缺损中的成骨过程。

研究团队首先通过XPS、SEM、FTIR等手段验证了ZPH纳米颗粒的成功合成与水凝胶的多孔结构（图1）。TIH在紫外光照射下3分钟内即可凝胶化，具有良好的可注射性与形状适应性。力学测试表明，0.5 wt% ZPH添加量下 hydrogel 抗压强度最优（273 kPa）。离子释放实验显示，Ca²⁺在24小时内快速释放（约60 mg/L），Zn²⁺则在7天内缓慢释放（第4天达2 mg/L），符合M1→M2极化时序需求。

图1. TIH的制备与表征 a) TIH合成示意图。b) ZIF-L、ZIF-L@PDA和ZPH纳米颗粒的高分辨率XPS谱图。c) ZIF-L、ZIF-L@PDA和ZPH纳米颗粒的SEM图像。d) TIH的溶胶-凝胶转变过程，显示其可注射性与快速凝胶能力。e) TIH的SEM及相应元素分布图，证实其多孔结构及Ca、Zn元素的存在。f) TIH的储能模量（G′）和损耗模量（G″）随频率变化。g,h) TIH在0.9% NaCl中随时间释放Ca²⁺ (g) 和Zn²⁺ (h) 的动力学曲线。

在细胞实验中，TIH展现出优异的生物相容性，显著促进BMSCs增殖与迁移（图2）。划痕实验显示其迁移闭合率高达79%。血管生成实验表明，TIH能诱导HUVEC形成完整血管网络，其促血管能力优于对照组。此外，TIH凭借PDA和蛋白中的硫醇基团有效清除ROS，恢复氧化应激下的细胞稳态，并通过对MRSA和E. coli的强烈抑制作用（12小时内抑菌率超90%）表现出良好抗菌性能。

图2. TIH的体外细胞相容性、迁移、血管生成与抗氧化能力 a) CCK-8检测BMSCs与不同材料共培养后的细胞活性。b) BMSCs与TIH共培养后的三维形态。Vinculin免疫荧光染色显示BMSCs在TIH内黏附与生长良好。c) 划痕实验检测不同处理下BMSCs的迁移活性。d) 通过测量伤口愈合面积定量分析BMSCs的迁移活性。e) 不同处理下HUVEC血管形成实验代表性图像。f) 不同处理下血管网络形成中网状结构与连接点的定量分析。g) DCFH-DA染色显示不同处理下细胞内氧化应激水平。在H₂O₂诱导的氧化环境中，TIH处理后DCFH-DA荧光减弱，表明其抗氧化能力。h) H₂O₂组细胞荧光强度定量分析。

进一步研究发现，TIH能时序调控巨噬细胞内Ca²⁺和Zn²⁺水平（图3）。第1天Ca²⁺爆发促进M1标志物（CD86、iNOS）表达，第3天Zn²⁺积累驱动M2标志物（CD206）上调，实现M1→M2表型转换。这一过程通过TRPC1-STAT1/NF-κB和STAT6/PPARγ信号通路分别介导，为免疫-成骨级联调控提供离子基础。

图3. TIH对细胞内钙锌振荡与巨噬细胞极化的体外调控 a) FCM检测干预1天和3天后巨噬细胞内Ca²⁺和Zn²⁺荧光强度。b,c) FCM定量分析Ca²⁺阳性 (b) 和Zn²⁺阳性 (c) 细胞百分比。d) 免疫荧光图像显示与TIH共培养的RAW264.7巨噬细胞从第1天M1表型向第3天M2表型的时序转变（蓝色：DAPI，绿色：CD206，红色：iNOS）。e) FCM检测巨噬细胞表面CD86与CD206表达。f) FCM对巨噬细胞表面CD86与CD206表达的定量分析。

在成骨分化实验中，与巨噬细胞共培养的BMSCs在TIH作用下表现出最高的ALP活性和矿化结节形成（图4）。免疫荧光与RT-PCR结果显示，成骨标志物（BMP-2、RUNX2、OCN）和血管生成因子（VEGF）表达显著上调，证实TIH通过免疫-成骨级联调控促进骨再生。

图4. 免疫-成骨级联调控对体外成骨分化的影响 a) 通过共培养TIH与RAW264.7巨噬细胞评估免疫-成骨级联调控对成骨分化影响的实验示意图。b,c) 不同处理下BMSCs的ALP染色 (b) 和ARS染色 (c)。d–g) 免疫荧光图像显示不同处理下BMSCs中成骨分化标志物BMP-2 (d)、RUNX2 (e)、OCN (f) 和VEGF (g) 的表达。h) BMP-2、RUNX2、OCN和VEGF的细胞荧光强度定量。i) RT-PCR分析BMSCs中BMP-2、RUNX2、OCN和VEGF的基因表达水平。

动物实验进一步验证了TIH的修复效果（图5）。Micro-CT显示TIH组缺损区骨再生明显，骨体积分数（BV/TV）、骨密度（BMD）和小梁数量（Tb.N）均显著高于对照组。H&E和Masson染色显示新生骨组织和胶原沉积增加，免疫组化与免疫荧光证实成骨与血管生成因子高表达，且巨噬细胞表型由M1向M2转变（图6）。重要器官未发现病理异常，表明TIH具有良好的生物安全性。

图5. TIH促进体内感染性骨缺损再生 a) 动物实验设计示意图。b) 术后8周颅骨Micro-CT三维重建图像。c–e) 不同处理下骨痂体积分数（BV/TV）、骨密度（BMD）和小梁数量（Tb.N）的定量分析。f,g) 术后8周颅骨H&E (f) 和Masson三色 (g) 染色图像。缺损区域用箭头标出。下图对应框中区域的放大视图。

图6. TIH在感染性颅骨缺损中的体内成骨、血管生成与免疫调节性能 a) 不同处理下术后颅骨中BMP-2、RUNX2、OCN和VEGF蛋白的免疫组化染色图像及定量分析。b) 不同处理下术后颅骨中CD86和CD206表达的免疫荧光染色图像及定量分析，揭示体内巨噬细胞极化情况。

该研究成功开发出一种能够时序调控免疫-成骨微环境的多功能水凝胶，通过Ca²⁺/Zn²⁺的序贯释放协调巨噬细胞极化与成骨分化，整合抗菌、抗氧化、促血管和成骨等多重功能，为感染性骨缺损修复提供了一种创新策略。该时序免疫调节策略不仅适用于骨再生，还有望拓展至糖尿病创面、牙周缺损和肿瘤术后骨重建等复杂感染病理环境，具有广泛的临床转化潜力。未来可进一步探索可见光引发体系或无紫外交联策略，以提升其临床应用安全性与适用性。

来源：高分子科学前沿

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