斑马鱼行为篇（131）：斑马鱼焦虑相关研究

大多数与焦虑相关研究的最终目标是建立斑马鱼的病理过程模型，采用不同的方法来研究斑马鱼的恐惧、压力和焦虑相关反应，探究恐惧的机制，并最终将研究成果转化应用于人类临床。

例如，三维机器人模型已被用于测量斑马鱼的焦虑-恐惧反应。通过设计一个模仿斑马鱼自然捕食者-印度枯叶鱼形态和运动模式的机器人，制造出了活的捕食刺激。

另一种刺激形式是由苍鹭（鸟的剪影）发动的攻击，其冲击水面。在存在捕食刺激的情况下，斑马鱼会做出回避反应。此外，斑马鱼对捕食者鱼的反应与捕食者的颜色和图案无关，而更多地与捕食者尾巴的摆动频率有关。

图： 机器鱼和机器鹭

与焦虑相关的研究也使用警报物质来进行，已知警报物质会在一系列鱼类物种中引发恐惧反应。警报物质在特殊的表皮棒状细胞中形成，并在皮肤受伤时释放。邻近的鱼会通过它们的化学感受器（嗅觉）检测到这种物质，随后鱼群（一群鱼）中鱼与鱼之间的距离会减小，然后鱼群会远离捕食者。已知有两种运动模式会因警报物质或其他引发恐惧的刺激而发生变化，即不规律运动和静止不动。静止不动被定义为完全不动，只有鳃偶尔会动，眼睛也可能会动。

鱼群凝聚力的增强也被认为是一种反捕食反应，因为鱼群中的鱼作为一个整体对捕食者来说更难捕捉，因为捕食者的注意力会被分散。在另一项研究中，急性暴露于警报信息素会导致斑马鱼探索水箱上部的潜伏期显著延长，静止不动和不规律运动的频率也会增加。从安乐死的斑马鱼中提取的约7毫升警报信息素溶液被急性添加到一个新的测试水箱中，22条鱼接受了这种急性处理。对于长时间暴露的情况，鱼在预处理烧杯中暴露于警报信息素30分钟，然后将它们转移到新的测试水箱中，20条鱼用于长时间暴露实验。长时间暴露于警报信息素并未在对照组和实验组之间产生任何显著的行为差异。结果证实，警报信息素每次都会在斑马鱼中引发相对简单但强烈的类似焦虑的行为反应。与对照鱼相比，长时间暴露于警报信息素的斑马鱼没有表现出显著的行为差异。因此，警报信息素似乎只在急性情况下有效，这反映了它作为向附近鱼群发出危险信号的自然用途。

毒死蜱是美国常用的一种有机磷农药（OP），在空气、灰尘和食物样本中，甚至在儿童的尿液样本中都检测到了一定水平的某些有机磷农药。为了研究因接触这种农药而导致的神经行为障碍，斑马鱼幼体被用于研究亚慢性水平的毒死蜱在其发育过程中对焦虑相关行为的影响。斑马鱼幼体发育迅速，在受精后2-3天（dpf）从卵膜中孵化出来，并在第一周内完全发育出所有成体器官。到4-5 dpf时，幼体的鳔充气并开始自由游动，表现出许多行为，如回避、猛冲、急游和惊吓反应。趋触性，即对边缘的偏好，是斑马鱼幼体的一种与焦虑相关的行为。所施用的最高剂量的毒死蜱，即1 μM，对幼体的运动、身体形态和体型有很强的毒性作用。在这个剂量下，幼体表现出抽搐行为，但无法正常游泳或移动；在这个浓度下，斑马鱼幼体的尾巴向上卷曲，且身体长度比正常情况短。

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在其中一个实验中，使用图像作为刺激物，因为嗅觉线索（如警报物质）很难根据需要随时开启和关闭，而使用活的捕食者可能会产生误差变化（例如，如果它真的攻击了作为猎物的鱼）。这些图像包括原始的同域捕食者印度枯叶鱼、另一种同域捕食者针鱼、在水箱侧面或上方移动的鸟的剪影、在水箱侧面和上方显示的模仿物体快速接近的扩展点，以及非引发恐惧的图像，包括单条和一群斑马鱼。观察到的对引发恐惧的刺激的另一种行为反应是跳跃，即利用尾鳍进行的单次快速跳跃。同样，还会出现“跃出”行为（试图进行有力且快速的类似跳跃的游泳动作），撞击玻璃。静止不动通常与漂浮不同，漂浮可能发生在水箱的任何位置，但静止不动只发生在水箱底部或鱼与物体接触时。另一种积极的游泳形式是剧烈摆动。这是一种有力的游泳动作，看起来就好像鱼试图游过水箱的玻璃，表现为朝着玻璃的圆周运动。除了少数几次跳跃和跃出之外，斑马鱼对针鱼的恐惧反应并不那么强烈。甚至印度枯叶鱼的图像或侧面的点在引发恐惧反应方面也不如从上方接近的点有效。鱼会根据它们与捕食者之间的距离、捕食者的饱食程度以及许多其他因素（包括是否有逃生路线），对接近的捕食者做出逃跑、竖起鱼鳍展示或甚至忽略捕食者的反应。活动能力的降低也可能是由非（恐惧）因素引起的。

当在黑色和白色的隔间之间自由选择时，斑马鱼表现出对黑色隔间的偏好，与啮齿动物模型类似，有研究认为这种偏好程度可能有助于衡量焦虑程度。根据一个假设，斑马鱼对光/暗的偏好可能会随昼夜节律而变化。通过记录在一个被分成两个隔间的水箱中的光/暗偏好来检验这个假设，一个隔间由LED灯照亮，另一个隔间的四周和顶部都覆盖着哑光黑纸。LED灯位于实验水箱的顶部。在水箱前方放置一台摄像机。记录斑马鱼从第一天上午8点到第三天晚上8点的行为。在第三天白天的9点到20点之间添加褪黑素，使水箱中褪黑素的最终浓度为0.1 mM。在第一天，鱼在上午8点到下午6点之间表现出对水族箱亮区的偏好。当时间到晚上8点时，这种偏好转变为对暗区的倾向。对暗区的偏好一直持续到第二天凌晨2点，此后开始下降，在上午8点达到最小值。同样的偏好持续了接下来的24小时。0.1 mM的褪黑素在上午10点时将鱼在暗区的平均时间比例增加到70%以上。这些结果表明，斑马鱼有明显的类似昼夜节律的倾向，喜欢待在暗区，同时褪黑素处理表明褪黑素可以调节斑马鱼的昼夜节律。褪黑素对斑马鱼行为的影响是剂量依赖性的。

成年斑马鱼在白天表现出较高的活动水平，因为它们需要检测捕食者、获取食物或寻找同类。在夜间，鱼会表现出短暂的不活动期，通常伴随着尾鳍下垂，这表明它们处于类似睡眠的状态。在夜间，它们更喜欢黑暗的背景，以尽量减少自己的可见性和运动活动。通过分析鱼在装置的白色隔间中停留的时间、隔间之间的穿梭频率以及在白色隔间中的趋触性、静止不动和快速游泳行为，来研究对白色隔间的回避情况。这项研究包括3个实验，在第一个实验中，一个偏好水箱被分成黑色和白色两个隔间。鱼首先在中间隔间适应5分钟，然后在两个隔间之间做出初始选择。用摄像机记录15分钟内的行为，进行了3次这样的试验。在15分钟的试验间隔时间内，鱼被养在适应水箱中。实验2与实验1相同，唯一的区别是试验间隔时间为24小时。进行了5次试验。在实验3中，10条鱼被单独转移到白色隔间，并且在15分钟内不允许离开该隔间。在这种处理之后，它们再次接受实验1的测试。结果表明，强制暴露（禁闭后试验）并没有改变鱼在白色隔间中停留的时间或一般的运动活动（穿梭频率），但它减少了鱼在白色隔间中快速游泳、贴壁或静止不动的时间比例。结果可能表明，对白色隔间的探索主要是由恐惧/焦虑驱动的，而不是由新奇感驱动的。

对黑暗地方的偏好可能是衡量焦虑的一种方式，但哪些测量方法可以被视为焦虑的衡量标准尚不清楚。在一项研究中，对受试者进行单独观察，单次观察时长约为2小时。观察过程包括初步的黑/白偏好测试、强制暴露于黑色和白色环境以及最后的黑/白偏好测试。每个测试持续30分钟。受试者在测试前平均有34%的时间在白色隔间，在测试后平均有36%的时间在白色隔间。62只受试鱼中，有21只在偏好测试中有50%或更多的时间在白色隔间，而41只在白色隔间的时间不到50%。大多数鱼更喜欢黑色隔间而不是白色隔间。静止不动是斑马鱼对应回避刺激的主要反应，静止不动可能是衡量焦虑最可靠的行为指标。

斑马鱼是群居鱼类，还有研究来检验群居行为与焦虑和压力之间的关系。该研究侧重于在光/暗箱偏好测试中，不同数量的斑马鱼受试鱼的影响。这个实验有四组，每组使用不同数量的受试鱼。在5分钟的适应期后，用摄像机记录15分钟内受试鱼的行为。受试鱼的组中对白色回避行为减少，这反映了群居行为在减轻焦虑和压力方面的防御机制作用。

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