《食品科学》：北京工商大学贾英民教授等：爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对白色念珠菌生物膜的抑制作用机制

乳制品的质量在很大程度上取决于原料奶的质量，微生物尤其是致病菌的含量是影响鲜奶质量的重要因素。研究表明，奶牛如感染乳腺炎念珠菌会导致其产生的鲜奶被污染，这种受感染的牛奶与正常牛奶混合增加了原奶中念珠菌的污染率，进而影响食品品质。引起奶牛乳腺炎的主要病原体是白色念珠菌，这是一种常见于人类和动物的深层条件致病酵母。

抗菌肽是一类小分子多肽，是生物体抵御外源病原微生物入侵而产生的一类物质，其在体外的抑菌研究已经相当成熟，越来越多的抗菌肽被发现，并表现出抑菌性强和抑菌谱广等特点。爱媛类芽孢杆菌（

Paenibacillus ehimensis

）是类芽孢杆菌属中的一个种，具有拮抗作用和广谱抑菌性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和病原真菌具有较好的抑制作用。本课题组前期从爱媛类芽孢杆菌（

P. ehimensis

）HD中分离纯化出具有广谱抑菌性的抗菌肽ehimensin，其对真菌具有良好的抑制效果。

河北科技大学食品与生物学院的王志新、黄玉清和北京工商大学食品与健康学院贾英民*等 以白色念珠菌为指示菌，考察爱媛类芽孢杆菌抗菌肽ehimensin对其生物膜形成的抑制作用，从芽管、菌丝、生物膜形成、生物膜清除、生物膜内菌体状态以及成膜基因等方面研究抗菌肽对白色念珠菌生物膜的影响，以期为新型抗菌剂的开发提供一定参考依据。

01

抗菌肽对白色念珠菌的抑菌活性

采用微量二倍稀释法测定抗菌肽对白色念珠菌的抑制作用，其MIC为8.28 AU/mL。通过时间-杀菌曲线进一步探究抗菌肽对白色念珠菌的抑菌活性，结果如图1所示，添加0.5 MIC抗菌肽对白色念珠菌抑制作用微弱，添加1 MIC和2 MIC抗菌肽则对白色念珠菌具有明显的抑菌和杀菌作用，最终菌落数与初始菌落数相比，分别降低了2.79、3.46（lg（CFU/mL））。

02

抗菌肽对白色念珠菌芽管形成的影响

抗菌肽对白色念珠菌芽管形成的影响如图2和图3所示，对照组芽管形成率为99.33%，白色念珠菌多以菌丝相形式存在。添加0.5 MIC抗菌肽对白色念珠菌芽管的形成影响不明显。添加1 MIC抗菌肽时芽管形成率下降为82.67%，白色念珠菌处于酵母相和芽管共存的状态，且与对照组相比，芽管长度较短，芽管的形成受到了很大程度的抑制。添加2 MIC抗菌肽时芽管形成率为0.33%，白色念珠菌以酵母相形式存在。

03

抗菌肽对白色念珠菌菌丝形成的影响

如图4所示，RPMI 1640培养基（含15%胎牛血清）会诱导白色念珠菌生成菌丝，0 MIC处理组中，白色念珠菌由酵母相转变为菌丝相，菌丝之间大量缠绕。0.5 MIC处理组在抗菌肽作用3 h后对芽管形成的影响不明显，但在作用24 h后可观察到白色念珠菌菌丝生长受到了很大的抑制，酵母相和菌丝相共存。结合2.2节结果，推测1 MIC处理组中部分白色念珠菌可能在前期形成芽管，但由于抗菌肽持续高效的抑制作用，导致菌体死亡或形成芽生孢子，以酵母相的形式存在。2 MIC处理组白色念珠菌不仅是酵母相，菌体生长繁殖也受到了严重的抑制，多数为单个菌体。

04

抗菌肽对白色念珠菌生物膜形成的影响

XTT可被细胞内的线粒体脱氢酶还原成水溶性有色的甲臜产物，在480～490 nm波长处有最大吸收。如图5所示，0.5 MIC处理组生物膜形成率为51.17%，而1 MIC和2 MIC抗菌肽处理不能使白色念珠菌形成生物膜。本研究结果显示抗菌肽也可以有效的抑制白色念珠菌生物膜的形成，降低其致病性。

05

抗菌肽对白色念珠菌预成型生物膜形成的影响

如图6所示，0.5 MIC处理组预成型生物膜形成率为81.57%，而1 MIC和2 MIC处理组不仅不能形成生物膜，还对预成型生物膜有一定的清除能力。根据先前报道，0.25 μg/mL（4 MIC）的抗真菌剂31C仅可抑制约30%的生物膜的形成。肽C18以质量浓度依赖的方式显著降低生物膜活性百分比，与对照组相比，质量浓度为32（1 MIC）、64 μg/mL（2 MIC）和128 μg/mL（4 MIC）的C18对生物膜生物膜形成的抑制率分别为87%、91%和92%。本研究结果表明爱媛类芽孢杆菌抗菌肽可以有效抑制白色念珠菌预成型生物膜的形成。

06

抗菌肽对白色念珠菌生物膜清除率的影响

如图7所示，在抗菌肽作用生物膜1 h后，0.5 MIC处理组清除率到达48.08%，1 MIC和2 MIC处理组清除率分别为64.10%和77.56%。随着抗菌肽作用时间的延长，不同处理组对白色念珠菌生物膜的清除率均达到100%。

已有报道显示，肽LfcinB15对白色念珠菌MIC为6.25，采用25 μg/mL的LfcinB15作用生物膜1 h后，清除率在30%左右。肽C18在作用白色念珠菌生物膜24 h后，128（4 MIC）、256 μg/mL（8 MIC）和512 μg/mL（16 MIC）的C18分别使成熟生物膜减少了39%、48%和57%。本研究结果显示，短时内抗菌肽对白色念珠菌的清除率高于之前的报道，说明本研究中的抗菌肽有较高的清除效率。

07

抗菌肽对白色念珠菌生物膜内菌体的影响

爱媛类芽孢杆菌抗菌肽与白色念珠菌生物膜作用后，生物膜的完整性遭到破坏。如图8所示，0 MIC处理组生物膜结构较致密，随着抗菌肽质量浓度的增高，生物膜逐渐稀疏，结构遭到破坏。

如图9所示，0 MIC处理组呈现绿色，且颜色较暗，说明生物膜内菌体的细胞膜比较完整，且生物膜结构较致密，透光性差。0.5 MIC处理组呈橘黄色，同时能看到很多绿色亮点，此时生物膜内部分细胞膜已经破损并且相比于0 MIC处理组生物膜结构变得稀疏。1 MIC处理组呈橘红色，生物膜内菌体破损加剧，生物膜呈网状结构，空隙增大。2 MIC处理组呈红色，说明生物膜内大部分菌体的细胞膜呈破损状态，生物膜也变得更加稀疏。

08

抗菌肽对白色念珠菌生物膜内菌落总数的影响

如图10所示，生物膜内菌落总数随着抗菌肽质量浓度的增加而减少，且1 MIC和2 MIC处理组和对照组相比差异显著（

P

＜ 0.05 ）。 0.5 、 1 、 2 MIC 抗菌肽处理组与对照组相比，生物膜内的菌落总数分别下降了 0.21 、 1.48 （ lg （ CFU / mL ））和 3.54 （ lg （ CFU / mL ））。由此可知，抗菌肽可通过减少白色念珠菌生物膜内活菌 数量发挥抑制作用。

09

抗菌肽对白色念珠菌生物膜成膜基因的影响

本研究中抗菌肽可通过影响白色念珠菌生物膜形成相关基因的表达从而抑制生物膜的形成。如图11所示，抗菌肽作用白色念珠菌细胞膜后，

ALS1

ALS3

HWP1

基因表达水平分别降低了 44.28 % 、 28.03 % 和 94.92 % ，

EFG1

ECE1

UME6

基因表达水平分别降低了 53.73 % 、 42.77 % 和 43.50 % 。抗菌肽通过降低黏附素水平、干扰由于环腺苷酸 - 蛋白激酶 A （ cAMP-PKA ）途径的破坏而导致的菌丝形成以及限制菌丝的长期维持来影响生物膜的形成。关于抑菌物质对白色念珠菌生物膜的抑制作用机制，也有很多类似的报道，如臭氧超细气泡水通过调控黏附和菌丝形成相关基因（

ALS1

ALS3

RAS1

EFG1

CPH1

等）的表达发挥抗生物膜作用。紫嘌呤通过降低菌丝特异性基因（

ALS3

ECE1

HWP1

HYR1

）的表达来抑制菌丝的生成。 7- 苄氧基吲哚通过调节菌丝特异性和生物膜相关基因（

HWP1

ALS3

ECE1

RBT1

）表达， 减少菌丝发育，从而抑制生物膜的形成。

10

白色念珠菌是乳制品污染的一种病原真菌，常用的巴氏杀菌不能彻底清除其产生的孢子，进而影响了产品质量，给消费者带来了严重安全风险。临床上白色念珠菌作为常见的真菌病原体，当宿主免疫功能或防御能力下降时，可引起局部或全身性疾病，形成的生物膜耐药性和毒力十分强盛。预防和治疗白色念珠菌感染的药物较少，随着白色念珠菌耐药性的增加，迫切需要寻找新的抗真菌方法和药物来解决这一复杂的问题。生物防治被认为是一种更有效、更安全的策略。因此，自然界中无毒害且高效的新型生物抗真菌剂成为了研究方向，其中抗菌肽在应对真菌防治方面受到了极大关注。抗菌肽是一种高效广谱的抑菌剂，其在体外的抑菌研究已经相当成熟，越来越多的抗菌肽被发现，并表现出抑菌性强和抑菌谱广等特点。抗菌肽作为新型的抑菌物质对细菌的抑菌机理报道较多，而对白色念珠菌的抑制机理报道较少，对其生物膜的抑制机理更加少。白色念珠菌产生的生物膜非常致密，之前的报道对生物膜的清除均不彻底，所以要寻找清除更加彻底的安全性更高的替代物质。

本研究以新型的抑菌物质抗菌肽作为抑菌剂，探究其对白色念珠菌生物膜的抑制作用。白色念珠菌的生长方式为出芽繁殖，但当机体免疫能力下降或抵抗力降低时，芽生孢子可发育为芽管进而形成菌丝，具有致病性。抑制芽管的形成可防止其进一步发育为菌丝，从而降低白色念珠菌的致病性。白色念珠菌的菌丝是其重要的病理机制，在致病过程中发挥着关键作用。菌丝是支持生物膜结构完整性的基本成分，并为附着额外的酵母细胞、假菌丝、其他菌丝以及多物种生物膜中的细菌提供支架。本研究结果表明爱媛类芽孢杆菌抗菌肽可以很好地抑制芽管的形成，阻止白色念珠菌酵母相向菌丝相转化，不能进一步形成耐药性较强的生物膜结构，从而在白色念珠菌生物膜形成的初始阶段成功地实施阻断，降低其致病性。

白色念珠菌的致病性与其形成生物膜的能力密切相关，生物膜对抑菌剂的耐受性比浮游细胞高得多。本研究结果表明爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对白色念珠菌生物膜形成的黏附有较强的抑制效果。抗菌肽能在较短的时间内降低生物膜的黏附能力，将其清除。由此可知，爱媛类芽孢杆菌抗菌肽不仅能抑制生物膜的形成，还能破坏成熟生物膜的维持。

本研究结果还表明爱媛类芽孢杆菌抗菌肽破坏了白色念珠菌生物膜结构的完整性，使其生物量减少，还影响生物膜内菌体的活性，造成菌体破损和死亡。Jafri等研究发现未经处理的白色念珠菌和热带念珠菌生物膜含有大量的细胞外基质，经过1.56 μg/mL和3.12 μg/mL的麝香草酚处理后生物膜形成受到不同程度的抑制，生物膜细胞解聚、基质产生减少、菌丝量减少。

生物膜形成是一个循序渐进的过程，爱媛类芽孢杆菌抗菌肽通过影响白色念珠菌生物膜成膜基因来抑制生物膜的形成。白色念珠菌首先黏附在基质上，然后开始生长菌丝。白色念珠菌生物膜形成的第一个关键步骤是黏附，这个过程依赖于几种称为黏附素的细胞壁蛋白。这些蛋白通过与特定的氨基酸或糖残基结合来促进与其他细胞的附着，包括上皮细胞和其他微生物细胞或非生物表面。白色念珠菌中黏附素家族有凝集素样序列（Als）家族，菌丝壁蛋白（Hwp）家族和单个蛋白质文件家族F/菌丝调节（Iff/Hyr）家族。菌丝特异性基因

ALS1

编码细胞表面相关糖蛋白，

ALS3

编码细胞壁蛋白，是菌丝特异性基因。

HWP1

是一种黏附基因，编码白色念珠菌的细胞表面蛋白，对菌丝发育和细胞黏附至关重要，帮助白色念珠菌细胞强烈附着在上皮细胞上，引起黏膜念珠菌病。本研究所用抗菌肽使菌丝特异性基因

ALS1

ALS3

HWP1

表达水平下调，从而影响白色念珠菌的黏附。

EFG1是一种与cAMP-PKA通路相关的转录因子，可直接或间接调节一定数量的菌丝特异性基因（

HWP1

ALS1

ALS3

ECE1

）。EFG1参与细胞形态的调节，是不同形态开关的主要调节因子，是生物膜发育和毒力所必需的。HWP1和ALS3是cAMP-PKA通路的下游组分，与EFG1调控相关联。

ECE1

是细胞伸长相关的基因，编码菌丝细胞伸长和生物膜形成所需的蛋白质。

UME6

是与生物膜分散相关的基因，可以增强白色念珠菌的生物膜形成。

ECE1

UME6

是长期维持菌丝生长和细胞伸长所需的基因。本研究中抗菌肽使转录因子表达水平下调从而影响菌丝的形成，同时使基因

UME6

和基因

ECE1

表达水平下调以影响菌丝的形成和长期维持。

结论

爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对白色念珠菌生物膜具有较好的抑制效果，可以有效抑制芽管、菌丝、生物膜的形成，提高生物膜的清除率，破坏生物膜结构的完整性；影响生物膜内菌体的活性，造成菌体破损和死亡，导致膜内菌落总数减少；通过降低成膜基因的表达量来抑制白色念珠菌生物膜的形成。本实验结果为白色念珠菌生物膜的抑制研究提供了参考，也为抗真菌物质的开发奠定了一定基础。

作者简介

第一作者：

王志新，女，博士，毕业于江南大学发酵工程专业，现为河北科技大学食品与生物学院教授，硕士生导师，河北省“三三三人才工程”三层次人选。主要从事食源性致病菌的抑菌研究，主要开展食源性致病菌相关生物源抑菌剂的开发、应用及抑菌机制研究。主持完成国家重点研发计划子课题1 项、河北省重点研发计划1项和河北省自然科学基金1 项，现主持河北省自然科学基金1 项和河北省重点研发计划1 项。发表学术论文30余篇，授权国家发明专利3 项，研制国家标准样品1 个，制订国家标准2 项。

本文《爱媛类芽孢杆菌抗菌肽对白色念珠菌生物膜的抑制作用机制》来源于《食品科学》2024年45卷第21期176-184页，作者：王志新，黄玉清，刘亚慧，刘丹丹，宁亚维，贾英民。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20240111-111。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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