Science | 张锋团队开发可比肩CRISPR的RNA引导新系统TIGR-Tas，有望带来基因编辑新变革

撰文 | 木兰之枻

RNA引导系统的核心特征是向导RNA （gRNA） 引导特定功能蛋白以识别并作用于互补的DNA/RNA序列。自然界中存在各种各样的RNA引导系统，如真核生物的microRNAs和piRNAs、真核/原核生物的snoRNAs、以及引领基因编辑技术变革的CRISPR-Cas系统。近年来研究者以CRISPR-Cas系统为切入点，通过序列/结构相似性和系统进化树分析，在原核生物IS200/IS605转座子超家族中发现了包括TnpB、IscB和IsrB在内的新型RNA引导系统OMEGA系统【1-4】（详见BioArt报道： ；； ） ，还在真核生物中发现了与CRISPR类似的Fanzor系统【5】（详见BioArt报道： ） 。然而，如果要想挖掘出更多样化的 RNA 引导系统，我们仍要探索多种新的数据库挖掘方法。

2025年2月27日，来自美国Broad研究所的张锋实验室在Science发表题为TIGR-Tas: A family of modular RNA-guided DNA-targeting systems in prokaryotes and their viruses的论文。文章基于结构和数据同源性迭代挖掘，在寄生菌和噬菌体中发现了新的RNA引导的DNA靶向系统TIGR-Tas，该系统的核心组分是串联间隔向导RNA阵列（TIGR）和TIGR相关蛋白（Tas），其中TIGR阵列能转录加工生产36bp长度的tigRNA，继而引导Tas蛋白特异性识别并编辑目标DNA。文章对TIGR-Tas具体机制的解析拓展了我们对RNA引导系统多样性及整体进化的了解和认识，并为基因编辑技术变革提供了基础。

研究者从SpCas9蛋白的RNA结合域 （RBD） 入手在数据库中进行结构相似性搜索以挖掘更多RNA引导系统，结果发现原核生物IS110转座酶包含类似的RBD域。之后研究者又通过迭代挖掘发现，Nop域蛋白家族包含与IS110转座酶RBD域类似的结构。Nop域蛋白家族中还包括C/D盒snoRNA系统以及真核剪接因子Prp31，其与IS110转座酶之间的演化关联也已被两项独立研究报道，这表明Nop结构域的RNA结合特性可实现多样化的功能。随后研究者又对微生物基因组及宏基因组数据库进行进一步的挖掘并发现了一系列包含IS110、C/D盒snoRNPs及Prp31的各类Nop蛋白家族。研究还发现，Nop家族蛋白编码基因通常与串联重复长阵列TIGR相关联。TIGR阵列由两种不同且交替出现的8-12bp的重复序列组成，两重复序列之间还包括9bp的间隔序列。总体而言，TIGR序列可分为边缘重复序列、间隔序列A、环状重复序列和间隔序列B四大部分。基于此，与TIGR阵列相关联的Nop域蛋白被称为Tas蛋白，其中TasA包含单独的Nop结构域，TasH的N端还包含HNH核酸酶结构域，TasR的N端则包含RuvC核酸酶结构域。

图1：TIGR-Tas识别并切割DNA的机制

功能研究发现，TIGR阵列可转录产生长片段的前体RNA，并可被进一步加工产生36bp长度的tigRNAs。鉴于TIGR-Tas与CRISPR-Cas的相似性，研究者推测tigRNAs可能作为Tas蛋白的向导RNA发挥功能。大肠杆菌中的RNP纯化实验发现，TaTasR-tigRNA形成的RNP复合物能与DNA共同纯化。体外生化实验表明，在tigRNA的引导下，TasR能够切割双链DNA。具体而言，间隔序列A/B分别与目标DNA双链互补并引导TasR切割DNA双链（图1）。但如果DNA单链与间隔序列仅部分互补，则TasR无法切割DNA链。随后研究者还证实，TasR蛋白的RuvC结构域是其核酸酶活性的关键区域，tigRNA的间隔序列A和B均以相同的方式引导DNA单链切割，切割位点均位于与间隔序列第五位碱基互补的核苷酸3’端，最终产生3’端有8bp粘性末端的双链断裂。研究指出，TasR是DNA特异性核酸酶，通过调整间隔序列A/B与DNA单链的互补与错配，TasR可实现对DNA单链的特异性切割。

研究者发现，除了识别切割机制的不同，TIGR-Tas与CRISPR-Cas9的另一大差异是不依赖PAM识别序列，这意味着TIGR-Tas有望实现全基因组范围的靶向编辑。基于以上结果，研究者对TIGR-Tas在人源细胞中的编辑能力进行了分析，结果显示，两种TasR蛋白TaTasR和ParTasR均能在人源细胞HEK293FT中实现目标位点的切割 （两种TasR的最高突变效率分别为0.8%和3.6%） 。

研究者还对TasR-tigRNA-DNA的RNP复合物结构进行了解析。总体而言，TasR会折叠形成一个经典的Nop结构，并通过卷曲螺旋结构域形成C2对称的二聚体结构，这与古菌C/D盒snoRNP中Nop5的形成方式相同。TasR二聚体会结合目标DNA和36bp的tigRNA。目标DNA双链的预期切割位点处与RuvC结构域活性位点相邻，且DNA底物进入/离开复合物时均会发生180°的剧烈折转。此外，tigRNA的边缘重复序列和环状重复序列均以“UG”序列开始，以“CCA”序列结束，这两种基序在边缘和环状重复序列中几乎总保持共变异，并与C/D盒snoRNA中的等效序列对应，CCA基序和UG基序也分别被称为“C盒 （box C） ”和“D盒 （box D） ”。

上述TIGR阵列包含双重重复序列，其相关联的Tas蛋白在系统发育树中隶属于Nop域蛋白家族，表明两者可能存在共同起源。研究者发现，Nop蛋白家族以外的Tas蛋白系统相关联的阵列并不包含双重重复序列，而是包含串联茎环序列。茎环阵列包含与TIGR阵列类似的两个8-12bp间隔序列，它们被C盒和D盒基序包围。茎环阵列与TIGR阵列的不同之处是不包含间隔重复序列：其中边缘重复序列被替代为能形成茎环结构的回文序列，环状重复序列则被替代为可变的间隔序列。茎环阵列结构的真实性在白足鼠肠道微生物组的基因座中得到了验证：该基因座编码TasA蛋白和13个茎环结构的阵列，茎环结构编码的RNA拥有与 snoRNAs类似的序列特征，均包含被C盒和D盒基序包围的双重间隔序列。因此，茎环阵列的发现证实了TIGR系统的多样性，而茎环阵列和双重重复阵列共有的保守特征则凸显了C/D盒向导RNA的核心和基本结构特性。

总体而言，研究者通过新的数据挖掘策略对原核生物和病毒中的RNA结合蛋白进行了深入研究并发现一种全新的RNA引导系统TIGR-Tas。该系统的TasR核酸酶在tigRNA引导下，可在人源细胞中特异性识别并切割双链DNA。与CRISPR系统相比，TIGR-Tas的独特之处在于，其对DNA识别依赖于tigRNA的两个间隔序列，但并不依赖PAM识别位点，因此具有更广阔的应用前景。TIGR-Tas系统的发现为RNA引导系统的多样化和进化研究提供了新的思路，也为基因编辑技术开发带来全新的视角。

science.org/doi/10.1126/science.adv9789

制版人：十一

参考文献

1. Xiang, G., Li, Y., Sun, J. et al. Evolutionary mining and functional characterization of TnpB nucleases identify efficient miniature genome editors.Nat Biotechnol(2023).

2. Karvelis, T. et al. PAM recognition by miniature CRISPR-Cas12f nucleases triggers programmable double-stranded DNA target cleavage.Nucleic Acids Res.48, 5016-5023 (2020).

3. Karvelis, T. et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.Nature599, 692–696 (2021).

4. Altae-Tran, H. et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.Science374, 57–65 (2021).

5. M. Saito et al. Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease.Nature620, 660–668 (2023).

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