Science丨血红素生物合成的起始酶ALAS1发挥非经典作用调控miRNA活性

撰文 | 格格

miRNA和siRNA都是由21-22个核苷酸组成的小RNA，它们可以引导Argonaute蛋白复合物靶向并结合到互补的mRNA 上，从而抑制其表达【1】。在哺乳动物中，miRNA通过核 Drosha-DGCR8复合物和细胞质Dicer的逐步切割产生，并最终与四种Argonaute效应蛋白 (Ago1-4) 结合。Argonaute 蛋白与适配蛋白GW182 （TNRC6） 协同作用，抑制与miRNA 5’ 端配对的靶标。过去二十年的研究主要集中在介导RNA沉默的正向作用因子上，例如Drosha、DGCR8和Dicer。然而，目前只有少数因子被发现可以抑制核心miRNA通路功能。

DGCR8是Microprocessor 复合物中的双链RNA结合 （dsRBD） 辅因子，它是一种血红素蛋白【2】。这意味着DGCR8需要血红素作为辅助因子才能发挥其功能。DGCR8 的N端Rhed结构域可以结合血红素。血红素与Rhed结构域的结合稳定了DGCR8-Drosha 二聚体，Drosha 是一种 RNase III 酶，负责切割 pri-miRNA【3-4】。血红素的存在增强了DGCR8和Drosha对pri-miRNA底物的特异性和活性。这意味着在没有血红素的情况下，Microprocessor复合物的功能会受到影响。尽管已经有一些体外实验研究了DGCR8与血红素结合的功能，但是细胞内血红素生物合成相关基因发生突变后对miRNA的影响尚未得到研究。

近日，来自美国纽约斯隆凯特琳研究所的Eric C. Lai研究团队在Science杂志发表题为Noncanonical role of ALAS1 as a heme-independent inhibitor of small RNA-mediated silencing的研究论文。5-氨基乙酰丙酸合酶1-ALAS1是血红素生物合成的起始酶。该研究揭示了ALAS1在细胞质发挥着非典型作用，尽管已知血红素是核 miRNA 加工的积极辅助因子，ALAS1作为一个血红素-非依赖性的miRNA抑制剂，通过抑制RISC组装和调节Ago2蛋白水平来降低 miRNA 水平。

研究人员首先在HEK293T细胞中构建了血红素合成途径中两个核心因子 （ALAS1和CPOX） 的基因敲除细胞系。实验结果显示，在血红素充足的情况下，ALAS1基因敲除细胞中的成熟 miRNA水平显著上升，而CPOX基因敲除细胞则没有出现这种变化。这表明ALAS1在miRNA生物合成中发挥着独立于血红素的重要作用。为了进一步验证ALAS1的作用，研究人员使用了一种pri-miRNA加工传感器，该传感器由一个带有pri-miRNA的萤火虫荧光素酶转录本组成。结果显示，ALAS1-KO细胞和CPOX-KO细胞在常规培养基中都没有表现出明显的差异。然而，当培养基中的血红素被去除后，两种基因敲除细胞系都表现出荧光素酶活性的增加，这表明血红素对Microprocessor复合物的功能有促进作用。

为了研究ALAS1对RISC组装的影响，研究人员使用体外RISC组装实验，并使用Pp-luc siRNA复合物作为底物。结果显示，ALAS1-KO细胞的细胞裂解物显著促进成熟RISC的形成，这表明ALAS1缺失可以促进RISC的组装。为了排除其他血红素生物合成因子的影响，研究人员还检测了CPOX-KO和ALAS1/CPOX双敲除 (ALAS1/CPOX-dKO) 细胞的RISC组装能力。结果显示，CPOX-KO细胞的RISC组装没有增加，而ALAS1/CPOX-dKO细胞的RISC组装与ALAS1-KO细胞相似。这进一步证明了ALAS1在抑制RISC组装中的特异性作用。

由于ALAS1主要在细胞质中发挥催化作用，研究人员推测细胞质中的ALAS1可能参与了 miRNA调控。实验结果显示，ALAS1缺失导致Ago2蛋白水平升高，而细胞质ALAS1前体蛋白可以抑制这种升高，并降低miRNA水平。为了进一步验证细胞质ALAS1的作用，研究人员构建了表达全长和截短ALAS1△N (缺乏线粒体定位信号) 的细胞系。结果显示，ALAS1△N可以抑制ALAS1-KO细胞中Ago2蛋白和miRNA的升高，表明细胞质ALAS1前体蛋白具有调节miRNA的功能。

为了研究ALAS1对miRNA沉默功能的影响，研究人员进行了Ago2 CLEAR-CLIP分析。结果显示，ALAS1-KO细胞中Ago2在miRNA靶位点上的占据增加，并且miRNA-Argonaute复合物对mRNA的沉默作用增强。为了验证ALAS1在小鼠中的功能，研究人员构建了Alas1条件性敲除小鼠模型。结果显示，Alas1敲除小鼠的肝细胞中成熟miRNA水平升高，并且 RNAi沉默功能增强。

细胞内血红素水平必须精确控制，因为它不仅是必需的辅因子，而且过量时也有毒性 。然而，ALAS1 反馈调节的机制可能产生不良后果，特别是在急性肝卟啉症 (AHPs) 中。这是遗传性疾病，由 ALAS1 下游特定血红素生物合成酶缺乏引起，其特征是急性神经内脏毒性。当肝脏 ALAS1 被诱导发作的因素 （例如，与月经相关的激素波动、CYP450 诱导药物等） 诱导时，血红素途径中的第三种酶，卟啉原脱氨酶 [(PBGD); 也称为羟甲基双吡咯合成酶 (HMBS)] ，可能成为限速步骤，导致中间体 δ-氨基乙酰丙酸 (ALA) 和卟啉原 (PBG) 积累。这些代谢物，特别是 ALA的神经毒性作用被认为是急性卟啉病发作的发病机制。因此，目前的治疗方法旨在抑制诱导肝脏 ALAS1 表达。血红素输注是治疗急性发作的标准方法，被认为可以提供外源性血红素以负反馈抑制肝脏 ALAS1。最近，靶向肝脏 ALAS1 的 RNAi 疗法在小鼠模型中证明有效，并有效预防人类患者的复发性发作。这些数据导致 ALAS1-siRNA 成为第二种获得FDA批准的RNAi 药物 (givosiran) 。

这项研究表明，ALAS1的消耗可能会增强RNAi介导的基因抑制。ALAS1在线粒体之外的非典型功能，作为RISC组装的抑制因子，从而抑制miRNA的积累。这项研究的发现为提高RNAi疗法的有效性提供了新的思路，并提示ALAS1抑制剂可能作为RNAi疗法的辅助剂。

原文链接：www.science.org/doi/10.1126/science.adp9388

制版人：十一

参考文献

1. R. Shang, S. Lee, G. Senavirathne, E. C. Lai,Nat. Rev. Genet.24, 816–833 (2023).

2. I. Barr et al.,J. Biol. Chem. 286, 16716–16725 (2011).

3. T. A. Nguyen, J. Park, T. L. Dang, Y. G. Choi, V. N. Kim,Nucleic Acids Res. 46, 5726–5736 (2018).

4. J. Quick-Cleveland et al.,Cell Rep. 7, 1994–2005 (2014).

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