你做质粒提取实验时，是否也遇到了这些常见问题？

质粒提取作为实验室常见的实验之一，对于很多研究者来说其实并不陌生，但纵观整个实验过程，每一处细节处理都十分关键，从前期的摇菌开始就关乎于质粒提取的成功与否，到了提取操作过程则更不用说；甚至提取后如果进行酶切或者转染等实验出现失败、结果不理想时，研究者还需重新考量质粒提取的质量是否过关，可见，要做好质粒提取实验并没有想象的那么容易。另外，很多研究者常常认为试剂盒提取以后就仅需进行浓度纯度的检测，而忽略了琼脂糖凝胶电泳的检测，其实这一检测步骤也很重要哦，干货太多，下面我们就一起来看看质粒提取实验的常见问题，小伙伴们可以自取所需哦~

1、菌液培养时间多久合适?

细菌培养时间建议不要超过16小时，菌液OD值在2.5-2.6左右为佳，培养时间短会导致菌体生长不充分，培养时间过长菌体会出现死亡，都会影响收集的菌体量，从而影响抽提出的质粒DNA的量。在接菌前，可以将保存的菌种先进行活化，然后再接菌，可使过夜培养的菌液生长更充分，在一定范围内菌体量的增加，可以提高所提质粒的浓度。

2、质粒提取试剂种类这么多，怎么选择适合的呢？

根据提取菌液量的大小，质粒提取试剂盒可分为质粒小提（1-5mL）、质粒小提中量（5-15mL）、质粒中大提（15-50mL）和质粒大提（50-300mL）四类；同时每一类中还可根据是否需要去除内毒素来进一步划分。研究者可以按照不同的实验需求，来选择相应的试剂盒，通常来说，对于常规的载体构建实验、测序需求，一般试剂盒都能达到要求；若后续做细胞转染实验则需选择去内毒素的质粒提取试剂盒。如不知道选择何种试剂品牌，则可以优先选择在提取试剂领域专业深耕，有产品口碑又有产品性能的品牌，如Qiagen、BIOG等。

3、质粒转染后细胞出现死亡或转染效果差，从质粒本身分析，原因可能有哪些？

如果下游转染出现以上问题，从质粒本身来看，可能是因为：

Ø未使用去内毒素的质粒提取试剂盒。内毒素可与质粒DNA竞争转染试剂，阻碍质粒DNA进入细胞，从而极大程度地影响转染效率；同时，由于转染试剂会使细胞膜的通透性增加，内毒素进入细胞，导致细胞活力降低甚至引起死亡，则会进一步影响转染效率。建议选用添加有高效含内毒素清除因子的质粒提取试剂，以高效清除提取质粒中残存的内毒素。鲎试剂测试表明，使用BIOG EndotoxinOUT 提取得到的质粒溶液，内毒素去除率可高达90%以上，可大幅提升细胞转染的效率。

Ø质粒纯度不够。在常规质粒提取试剂中，碱裂解法最为常用，但要注意其操作过程中，动作必须尽量温和，否则基因组DNA会由于剧烈操作而被破坏成小片段，在中和过程中被复性，保留在上清中随质粒DNA一同被回收，不仅会导致分光光度计测定的质粒DNA浓度值虚高、影响质粒提取的纯度，还会影响后续的转染效率。因此，质粒提取后进行琼脂糖凝胶电泳就显得非常有必要，可检测质粒中是否含有残留的基因组DNA或RNA，便于研究者对质粒质量有更好的把控。

4、质粒DNA产量低或提取失败的原因?

l菌种活性不佳：如菌种保存时间过久，质粒可能丢失，建议培养前先划线活化，以稳定产量；如大肠杆菌太陈旧（低温下长期保存的菌等），建议重新涂板培养后挑选新菌落进行液体培养；

l未充分裂解细菌：细菌需充分重悬，成团的细菌会因无法裂解降低产量；

l裂解时间过长；

l质粒本身拷贝数低。载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有2-3倍的产量波动（每毫升培养过夜的菌液产量为3-16μg）；长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为0.5-2μg；低拷贝质粒可以增加起始菌液量来提高浓度；

l菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。

5、如何提高质粒提取的得率？

l菌液样本量和提取试剂用量比例合理。质粒提取过程中，并非菌体量越高提取产量越高，投入过多的菌液，会导致菌体裂解不充分，在适合范围内增加菌液量并适当添加提取试剂的使用量，两者比例合理，以能够充分裂解为佳，可提高质粒提取得率。

l彻底裂解菌体细胞壁。建议选用含有高效菌体裂解酶的质粒提取试剂，如BIOG系列质粒提取试剂，组分溶液Ⅱ中内置专研高效裂解酶，可充分降解细胞壁中的肽聚糖和蛋白质，使DNA释放到溶液中，提高质粒提取得率。

l选择吸附能力强的吸附膜。吸附膜虽不太受研究者关注，但国产和进口吸附膜在吸附性能上仍有一点差距。目前，进口化学修饰离子膜比一些国产膜要更薄一点，但吸附能力超越普通的膜。据了解除了像Qiagen这类国外大牌试剂，国内百代生物也已采用进口美产离子膜，使用这类膜进行提取对于质粒得率的提升具有更加显著的效果。