Nature Plants | 张秀任团队揭示正向调控pri-miRNA二级结构的关键因子

责编 | 王一

近日，美国德州农工大学张秀任教授团队在Nature Plants杂志在线发表题为RNA helicase Brr2a promotes miRNA biogenesis by properly remodeling secondary structure of pri-miRNAs的研究论文。 该研究报道了RNA解旋酶Brr2a通过重塑pri-miRNA的二级结构促进成熟miRNA的生物合成。这一发现不仅首次报道了pri-miRNA二级结构的正向调控因子，而且揭示了Brr2a在剪接体以外的重要功能。

MiRNA是一类广泛存在于动植物中的长度在21~25nt的内源性非编码小RNA，在基因表达调控中起重要作用。在植物中，其MIRNA基因由RNA聚合酶II转录产生初级miRNA（pri-miRNA），并在DCL1（Dicer-like 1）、HYL1和SERRATE等蛋白组成的加工复合体（Microprocessor）作用下经过连续剪切，形成双链miRNA/* (互补链)。最后，miRNA被装载到AGO1蛋白上形成RNA诱导的沉默复合物（RNA Inducing Silencing Complex, RISC）。RISC通过碱基序列配对的方式靶向到目标基因，切割靶标RNA或者抑制其翻译过程从而调控目标基因的表达【1】。

一系列重要的研究发现pri-miRNA的加工依赖于其分子内部配对形成典型的的发夹结构，包括了底部（base），茎（stem），和环（loop）区间（图1a）【2】。张秀任课题组此前的研究报道了染色质重塑因子2 （chromatin remodelling factors 2，CHR2）通过与SERRATE互作干扰pri-miRNA的二级结构以抑制成熟miRNA的产生【3】。更为重要的是，张秀任教授课题组在24年6月最新发表的《Nature Plants》文章中通过多维度的高通量测序技术揭示了植物中pri-miRNA二级结构多样性远比哺乳动物复杂。该研究进一步用体内实验数据阐明，植物pri-miRNA除了采用动物中经典的底部到环（base to loop，BTL）切割方式外，还存在连续的底部到环（sequential BTL，sBTL），环到底部（loop to base，LTB）， 连续的环到底部（sLTB）和双向的（bidirection）切割（图1b）【4】。这些发现揭示了植物中存在更为复杂的调控网络。然而，目前对于哪些因子能够正向调控pri-miRNA的二级结构促进miRNA的生物合成仍然有待进一步研究。

图1. Pri-miRNA的二级结构影响加工。a, 典型pri-miRNA的示意结构。b, Pri-miRNA五种加工模式：底部到环（BTL）、连续的底部到环（SBTL）、环到底部（LTB）、连续的环到底部（SLTB）和双向加工。在每种情况下，DCL1（双链RNA特异性核糖核酸酶）最初在距离参考单链RNA-双链RNA结合处约15-17个核苷酸的位置切割初级miRNA（15-17核苷酸分子标尺）。初级miRNA图示中的蓝色和粉色区域代表miRNA/*双链。

RNA解旋酶具有水解ATP/GTP活性，并能重塑RNA的二级结构。为了筛选参与miRNA产生的RNA解旋酶，张秀任团队借助Microprocessor重要组分（SE和HYL1）的蛋白质谱数据和泛转录组的联合分析，获得了候选基因RNA解旋酶Brr2a。随后，免疫共沉淀（Co-IP）和双分子荧光互补（BiFC）实验验证了Brr2a与HYL1间的蛋白互作。更为重要的是，小RNA测序和RNA测序结果进一步表明，Brr2a和HYL1协同促进104个miRNA的产生，并共调控超过一千个差异表达基因。这些结果表明，Brr2a很可能是miRNA加工复合体的一个新的正向调控组分。

Brr2a是剪接体中U5小核糖核蛋白复合体的重要组成成分，其功能缺失会导致胚胎致死。在植物中，约三分之一的pri-miRNA含有内含子。作者在人工敲低表达量的突变体brr2a-3中检测到含有内含子的pri-miRNA的不恰当剪接以及相应miRNA的生成受损。出乎意料的是，与野生型相比，brr2a-3突变体中大部分不含有内含子的pri-miRNA所产生的miRNA也显著降低（图2）。这些结果暗示，Brr2a很可能以一种不借助其剪接功能的途径促进miRNA的生物合成。

图2. Brr2a促进来自含内含子和不含内含子的pri-miRNA的miRNA积累。 a.b. 图表显示了来自含内含子(a)和不含内含子(b)的pri-miRNA的miRNA的小RNA测序谱。

作者随后检测Brr2a是否通过RNA解旋酶的功能促进pri-miRNA产生。RNA免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation，RIP）实验表明Brr2a在体内可以结合结构性RNA，且HYL1可以增强这种结合。Brr2a具有N端和C端串联的两个RNA 解旋酶结构域。通过凝胶阻滞（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）和ATPase水解实验发现，Brr2a通过N端RNA解旋酶结构域结合底物，并且这一结合过程显著激活了其ATPase水解酶活性。作为回馈，Brr2a可以在体外解开配对的双链RNA（图3a和b）。当引入解旋酶活性缺失（S676A和T678A）或ATPase活性缺失（E640Q）的突变时，Brr2a的解旋酶和ATPase活性均被阻断。遗传互补实验进一步证实，ATPase活性或解旋酶活性缺失均无法回补brr2a-2点突变体的叶片缺刻的形态表型和miRNA水平降低的分子表型。因此，生化和遗传数据共同证实Brr2a作为RNA解旋酶，能重塑底物pri-miRNA的二级结构，从而促进miRNA生物合成。

为了更深入探究Brr2a对植物体内的pri-miRNA二级结构的影响，作者应用DMS-MaPseq检测了brr2a突变型背景下pri-miRNA体内的二级结构。测序结果显示，突变体相比野生型呈现出更高的基尼指数，暗示突变体中pri-miRNA具有更紧密配对的二级结构。以具体的pri-miRNA为例：BTL型的pri-miR158a在突变体中，在第一个切割位点处呈现出更大的内部环，阻碍了Microprocessor的切割，从而抑制了成熟miRNA的产生。连续LTB型的pri-miR159a在突变体中表现出，上茎部切割位点处的内部环更加闭合，同时在第一组小RNA/*双链处含有更多开放的区域，另外下茎部内部环也更加闭合，这些变化都将影响Microprocessor中DCL1切割的效率和准确性；双向加工型pri-miR165a在突变体中失去了动态的二级结构，而且形成的更开放的分支末端环二级结构在体外实验中被证实会导致错误性加工（图3c）【5】。因此，DMS-MaPseq进一步表明Brr2a促进pri-miRNA在植物体内形成更适合于Microprocessor加工的二级结构。

图3. RH Brr2a结合并重塑pri-miRNAs。 a. 示意图说明了生成三种双链RNA和体外解旋实验的流程。b. 体外实验中Brr2a解开双链pri-miR159b。c. 双向加工型pri-miR165a的二级结构变化。

综上，Brr2a在miRNA生物合成途径中具有双元功能：一方面，它可以参与还有内含子的pri-miRNA的剪切，使其加工成为更适合切割的pri-miRNA的形式；另一方面，它可以有效重塑具有内含子和不具有内含子的pri-miRNA的二级结构，使其更适合于miRNA加工复合物的剪切。

美国德州农工大学的李鑫娣博士和钟嵩潇助理研究员为共同第一作者，张秀任教授和钟嵩潇助理研究员为共同通讯作者。德州农工大学李长昊博士参与测序数据的分析，严星星博士和朱佳莹博士参与了DMS-MaPseq的测序文库构建，李雁军博士（现宁波大学副研究员）构建了小RNA测序文库、王智烨博士（现浙江大学研究员）构建了brr2a-3转基因植物材料。本研究同时获得了美国德州农工大学彭旭副教授的指导与支持。本研究得到了美国国立卫生院, 美国国家自然科学基金委及韦尔奇基金会的资助。

据悉，张秀任教授团队主要从事RNA生物学相关工作，在植物非编码RNA合成及表观遗传沉默机制、RNA二级结构形成以及病毒-宿主互作等研究领域取得了系列突破性成果, 发表在《Cell》《Nature》《Nature Plants》《Developmental Cell》《Nature Structural & Molecular Biology》《Nature Communication》《Science Advances》《PNAS》《eLife》等一系列高水平期刊。张秀任教授任德州农工Chancellor EDGES, Presidential Impact Fellow, Christine Richardson Endowed教授，主持多项NSF（包括杰出研究者基金）及NIH R01 和R35科研项目并长期担任美国国立卫生院(NIH)，美国国家自然科学基金委 (NSF) 评审委员会成员，担任多个国际顶尖期刊审稿人。

该团队目前经费充足，已开放多个职位，欢迎感兴趣的博士后和研究生申请加入。

参考文献

1 Song, X., Li, Y., Cao, X. & Qi, Y. MicroRNAs and Their Regulatory Roles in Plant-Environment Interactions. Annu Rev Plant Biol 70, 489-525 (2019). https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-050718-100334

2 Shang, R., Lee, S., Senavirathne, G. & Lai, E. C. microRNAs in action: biogenesis, function and regulation. Nat Rev Genet 24, 816-833 (2023). https://doi.org/10.1038/s41576-023-00611-y

3 Wang, Z. et al. SWI2/SNF2 ATPase CHR2 remodels pri-miRNAs via Serrate to impede miRNA production. Nature 557, 516-521 (2018). https://doi.org/10.1038/s41586-018-0135-x

4 Yan, X. et al. Parallel degradome-seq and DMS-MaPseq substantially revise the miRNA biogenesis atlas in Arabidopsis. Nature Plants 10, 1126-1143 (2024). https://doi.org/10.1038/s41477-024-01725-9

5 Zhu, H. et al. Bidirectional processing of pri-miRNAs with branched terminal loops by Arabidopsis Dicer-like1. Nat Struct Mol Biol 20, 1106-1115 (2013). https://doi.org/10.1038/nsmb.2646

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41477-024-01788-8