《AFM》刘鉴峰/杨丽军：锰离子配位的自组装多肽水凝胶佐剂用于激活体液免疫和细胞免疫

中国协和医科大学放射医学研究所刘鉴峰研究员和杨丽军副研究员团队在Advanced Functional Materials上发表题为“A Mn2+-Assisted Nanofiber-Hydrogel Adjuvant for Simultaneous Enhancement of Humoral and Cellular Immune Responses”的研究论文。锰离子是一种新近发现的STING激动剂，可用于免疫反应的增强。然而，游离形式的锰离子在体内几乎不引起免疫反应。鉴于此，研究人员通过在自组装多肽分子中引入锰离子结合氨基酸模块，使其可在金属配位作用力帮助下与锰离子形成新的超分子组装体水凝胶。作者首先对锰离子与多肽分子的配位模式进行了详细探究，证明两者是以配位形式相互作用。进一步体外实验中，作者验证了水凝胶体系完全保留锰离子激活cGAS-STING通路的能力。体内动物实验表明该水凝胶具有优异的锰离子缓释能力，可诱导与铝佐剂相当强度的体液免疫反应。随后，作者使用两种模式抗原证明该水凝胶佐剂可以诱导抗原特异性CD8+T细胞产生，对包含该抗原的荷瘤小鼠展现出极强的抑制作用，并明显延长荷瘤小鼠生存期。本研究开发的新型佐剂为锰离子相关佐剂的研发提供了新的思路。其组成成分明确，制备过程简单，有利于后期进行临床转化应用。

其设计的肽都是使用标准固相肽合成法（SPPS）合成的。p（Nap-ffh DEH，Nap =萘乙酸，F =苯丙氨酸，H =组氨酸，D =天冬氨酸，E =谷氨酸）因其在水溶液中的优异溶解性和出色的组装能力而被选作后续实验。如图 1A 所示，P 可独立自组装成纳米纤维结构，最终形成弱水凝胶（Pgel）。引入 Mn2+后，P 继续自组装成纳米纤维，从而形成水凝胶（MnPgel）。通过能量色散 X 射线光谱（EDS）确认了 P 与 Mn2+共同生成的纳米纤维中 Mn 的存在和均匀分布。EDS 图谱清楚地显示了纳米纤维上锰元素的普遍存在（图 1B），同时还检测到了碳元素（图 1B），证明了 P 和 Mn2+ 的稳定螯合（图 S3，佐证资料）。[17]两组水凝胶都表现出较高的弹性模量（G′），而不是相应的粘性模量（G″），这表明水凝胶具有类似固体的固有特性（图 1C）。值得注意的是，MnPgel 的 G′值高于 Pgel，这表明 Mn2+增强了水凝胶的机械性能。此外，增大应变扫描测试表明，MnPgel 比 Pgel 更稳定（图 1C）。氯化锰的归一化高分辨率锰 2p 光谱被解卷为三个光电子峰，分别位于 642.28 (2p3/2)、646.98 (卫星峰) 和 654.08 eV (2p1/2)。而在 MnPgel 纳米纤维中，三个Mn 2p峰略微偏移到较低的结合能（图 1D），这表明 Mn2+可能在自组装过程中与 P 配合。所有上述结果表明，Mn2+在P的动态自组装过程和特性中发挥了重要作用，同时导致水凝胶的机械属性发生了显著变化。

图一.Mn2+促进了p的自组装

为了精确量化 Mn2+ 和 P 之间的结合率，他们进行了等温滴定量热法（ITC），以获得全面的热力学曲线和结合化学计量学。他们将 Mn2+ 溶液（10 毫米）滴定到 P 溶液（250 微米）中，并观察相关的热量变化。Mn2+-P 相互作用的 ITC 热图显示了一个内热结合过程（图 2A）。然后，他们采用单位点结合模型进行了非线性曲线拟合分析（图 2A）。根据拟合过程计算出了几个关键参数，包括 N（结合化学计量学）、KD（结合常数）和ΔH（焓），并列于图 2A 中。拟合曲线的 N 值为 1.91，表明一个 P 分子可与 1.91 个 Mn2+ 分子结合。这一结果与加入不同比例的 Mn2+ 后纳米纤维形态变化的观察结果十分吻合（图 1G）。

图二. Mn2+和P之间的配位模式

他们首先用 MnPgel或其他对照材料（PBS、MnCl2和Pgel）培养骨髓树突状细胞（BMDCs）。流式细胞计数结果显示，MnPgel能诱导DCs表面上调率最高的成本刺激分子CD80和CD86（图3A）。与之前关于自组装肽能激活DCs的研究一致，单独的Pgel也能显著促进BMDCs的激活。因此，他们认为 Mn2+和P都有助于 BMDCs 的成熟。为了进一步研究先天性反应，他们在肌肉注射后48小时测定了引流淋巴结中的 DCs 募集情况。结果显示，MnPgel组招募了最多的 CD11b 低阴性 DCs（图 3B）。CD11blow或CD11b- DCs，又称cDC1s，因其在Th1细胞许可的促进下具有强大的细胞免疫应答能力而被广泛认可，能有效地处理和交叉呈现MHC I类分子上的抗原，从而激活抗原特异性CD8+T细胞应答。然后，他们进行了 RNA-seq 分析，以探讨不同处理下 BMDCs 的转录组特征。随后，他们对 RNA-seq 数据中与先天性免疫反应相关的几个基因集进行了详细分析。值得注意的是，他们观察到 MnPgel 和 Mn2+在趋化因子、细胞因子、干扰素刺激基因（ISGs）、干扰素（IFNs）以及与 DC 成熟相关的基因方面表现出一致的表达模式（图 3D）。除了利用高通量 RNAseq 分析外，他们还采用了定量 PCR（qPCR）技术来精确量化人类单核细胞模型-THP1 细胞中代表性 ISGs 的表达水平。在 Mn2+组和 MnPgel 组中，四种 ISGs（ISG15、OAS1、Viper 和 MX1）的相对 mRNA表达均显示出明显的 Mn2+剂量依赖性模式（图 3E）。

图三. 锰凝胶促进了树突细胞的成熟，并诱导了类似的基因表达模式

机制上来说，Mn2+诱导的DC成熟依赖于cGAS-STING通路的激活。western blot结果显示MnP凝胶治疗诱导了BMDCs和THP1细胞中STING、IRF3和TBK1的磷酸化 。MnP凝胶显著诱导IFN-β的分泌治疗（图4D), 进一步的qPCR分析证实IFN如IFN-β1、IFN-α1和IFN-α2在转录水平受到调控。尽管观察到TNF-α和IL-6的高水平表达（图4E），MnP凝胶或Mn2+与LPS治疗相比，诱导了有效的促炎细胞因子IL-1β和反馈性抗炎细胞因子IL-10和IL-12a的相对较低的表达水平。结果表明MnP凝胶能激活先天免疫系统，但引发全身炎症的风险较低。

图4. MnPgel可激活 cGAS-STING 通路并诱导下游细胞因子的表达

中性粒细胞增强和持续激活树突状细胞凝胶激励了他们评估对体液免疫反应的后续影响。通过ICP-MS对注射部位的肌肉组织进行Mn以及MnP凝胶的保留时间评估。MnCl2注射仅保留锰几个小时小于3小时，而MnP凝胶将锰在肌肉中的滞留时间延长至8天。如图所示进行小鼠肌肉免疫和血清收集。初次加强免疫后，在指定的时间点收集血清样品用于抗体滴度检测。他们发现MnP凝胶诱导出与明矾相当的高水平OVA特异性IgG和IgG1抗体（图5C)。长期抗体监测也表明MnP凝胶诱导类似明矾的持久抗体反应。引流淋巴结（dLNs）是佐剂介导的抗原摄取和启动特异性免疫反应的关键部位。MnP中dLNs的体积和重量凝胶-处理的小鼠与其他处理相比明显增加。如图所示5F，MnP凝胶在引流淋巴结dLNs中诱导了比常规明矾佐剂更高比例的Tfh细胞（p= 0.004).Tfh细胞频率的增加为B细胞提供了必要的帮助，并如预期的那样促进了其克隆扩增（图5G)。

图5. 锰凝胶通过促进 GC 的形成诱导抗体的产生

为了进一步描述MNP凝胶是否诱导CD8+基于t细胞的细胞免疫反应，他们测试了免疫小鼠脾脏中产生细胞因子的细胞。分别在第1天和第14天通过两次注射，通过初免-加强免疫策略免疫小鼠。用MnP凝胶免疫的小鼠诱导了最多（5.43%）的OVA表达的特异性CD8+t细胞。通过OVA蛋白或OVA肽重新刺激脾细胞（图6B）来检测抗原特异性产生IFN-γ的T细胞。C图和D图通过IFN-γ酶联免疫吸附斑点（ELISpot）试验所进行的，MnP凝胶-给药的小鼠对OVA蛋白或OVA肽的抗原特异性T细胞反应显著改善。具有长期记忆的强大细胞免疫反应，鼓励他们评估荷瘤小鼠模型的保护效力。在皮下接种B16-F10-OVA细胞之前，用含有不同佐剂的OVA免疫小鼠（图6E)。值得注意的是，当所有对照组中的肿瘤达到1500 mm3时在大约20天内，他们没有观察到肿瘤的出现，即使在MnP凝胶中持续60天处死小鼠。此外，他们评估了MnP凝胶的治疗效果在确定的肿瘤上（图6G）和肿瘤复发（图6I)。可以观察到MnP凝胶显著降低肿瘤生长并有效抑制术后肿瘤复发。

图6. MnPgel促进抗原特异性T细胞反应

文献主要结论:

1. 在本研究中，构建了一个由芳香族模块和Mn2+组成的短肽结合氨基酸。Mn2+增强的有序组装能力导致纳米纤维的构建，也导致水凝胶的宏观形成。

2. 展示了MnP凝胶疫苗接种导致高水平的抗体诱导和抗原特异性T细胞反应。这些观察表明MnP凝胶可用作感染性疾病和肿瘤衍生的新抗原的疫苗平台来治疗癌症。

3. 研究为佐剂的开发提供了一个新的范例。值得探索新的肽序列及其与其他PRR激动剂的组合，以开发适用于不同疾病背景的新型佐剂。

全文链接：

https://doi.org/10.1002/adfm.202315442

来源：纳米生物技术