同济东方何志颖教授团队：清除衰老细胞可促进肝细胞移植再生肝脏

（来源：同济东方何志颖组，Timepie首发）

背景

细胞衰老是一种独特的细胞命运，其特征是细胞在应答一系列内在和外在压力时出现DNA复制阻滞。p16和p21作为衰老细胞的主要标志物，被广泛使用。目前常用于开展体内衰老细胞研究的转基因动物模型包括INK-ATTAC，p16-3MR，p16-Cre等小鼠模型，这些模型在衰老与疾病相关机制探索以及衰老细胞清除药物的筛选中发挥了重要作用。但这些模型均以p16为标记，限制了我们对衰老生物学的全面认知。考虑到p16+细胞和p21+细胞的异质性，以及p21+细胞的体内作用在很大程度上仍然未知，研究团队构建了用于研究p21+衰老细胞的新型小鼠模型——p21-ATD小鼠模型。三个不同的功能基因插入至p21终止密码子前，功能基因之间以2A（切割酶）连接，使其表达蛋白在翻译水平上实现分离，Akaluc （新型荧光素酶）弥补了传统的Luc（荧光素酶编码基因）深层组织发光较弱的缺点，tdTomato是目前亮度最强、稳定性较高的荧光蛋白，DTR-DT自杀系统的特异性可诱导衰老细胞的凋亡并有效保护非衰老细胞。p21-ATD小鼠模型可以同时实现对衰老细胞的活体示踪、流式分选和体内清除。利用该模型可以更好地评估衰老细胞的特征与生理意义，同时该模型也可以作为Senolytics药物筛选以及药物疗效评估的重要动物模型。

近日，同济大学附属东方医院何志颖教授团队在期刊《Molecular Therapy》上发表题为“A p21-ATD Mouse Model for Monitoring and Eliminating Senescent Cells and Its Application in Liver Regeneration post Injury”的研究论文。

研究成功构建了p21-（Akaluc-tdTomato-Diphtheria Toxin Receptor[DTR]）（ATD）小鼠模型，以研究在老年和肝损伤动物中表达p21的衰老细胞的未知机制。这些功能基因的成功表达可同时实现体外示踪，流式分选以及体内清除p21+衰老细胞。

利用该小鼠模型，研究团队发现，在自然衰老过程中，p21-ATD小鼠的多个组织器官中均发现了一定比例的p21+衰老细胞，而清除老年p21-ATD小鼠体内的p21+衰老细胞可有效改善其生理功能，缓解炎症微环境。

结合单细胞测序及p16-3MR模型，团队共同证实衰老肝细胞倾向于表达p21，而p16倾向于在衰老非实质细胞中表达，证明了肝脏衰老的异质性。利用p21-ATD小鼠和富马酰乙酰乙酸水解酶（Fah）小鼠（肝损伤模型）杂交构建p21-ATD/Fah-/-小鼠，研究首次发现清除衰老肝实质细胞可有效缓解宿主肝脏的炎症并促进外源肝细胞的再殖效率。

同济大学附属东方医院为第一完成单位，同济大学何志颖教授为本文唯一通讯作者，博士研究生陈苗苗、吴国秀，硕士研究生卢艳丽为共同第一作者。

https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2024.04.002

研究发现

在这项研究中，研究人员首先利用测序验证了ATD基因插入的准确性。为了验证转基因的功能活性，又获取P21-ATD小鼠的鼠尾原代成纤维细胞，利用H2O2诱导其衰老。SA-β-gal染色结果表明，细胞经H2O2处理后衰老半乳糖苷酶的活性明显增加，成纤维细胞被有效诱导衰老。

免疫荧光验证经衰老诱导的P21-ATD小鼠成纤维细胞P21及tdTomato、DTR呈共定位表达，IVIS活体光学成像系统检测到来源于p21-ATD小鼠的成纤维细胞诱导衰老后Akaluc生物发光显著增强，流式凋亡检测到DT可有效诱导衰老的p21-ATD小鼠来源的成纤维细胞的凋亡但对未经衰老诱导的成纤维细胞无明显影响。以上结果初步证明了p21-ATD小鼠插入基因的功能表达良好。如下图：

图注：p21-ATD小鼠模型的构建与验证

随着年龄的增长，老年个体身体机能下降，导致体能虚弱，系统内稳态受损。研究团队发现老年p21-ATD小鼠全身Akaluc生物发光及tdTomato荧光表达升高，各器官组织中均出现一定比例的p21+衰老细胞，其中脂肪和肺组织衰老程度最为显著。而注射DT清除衰老细胞后，老年小鼠全身Akaluc生物发光及tdTomato荧光表达下降，各器官组织中p21+衰老细胞比例减少。

此外，清除衰老细胞后的老年小鼠的弓背情况改善，悬挂耐力时间延长，食物摄入量增多。血清学指标也显示白蛋白（ALB）水平的上升，总胆固醇（TC）和肌酐（CR）水平的下降。

研究团队还发现，与年轻对照组相比，老年p21-ATD小鼠的CD8+ T细胞比例降低，而CD11b+ F4/80+巨噬细胞和CD11b+Ly6G+MDSCs（髓源性抑制细胞）比例增加。而衰老细胞清除后，以上免疫表型均发生了逆转，且老年小鼠心、肝、脾、肺、肾等各器官组织的SASP炎症因子表达水平也显著下降，以上结果证明衰老细胞的清除可有效改善老年机体的生理机能，缓解炎症。如下图：

图注：清除衰老细胞提升了衰老小鼠的身体功能

研究团队分析了来自小鼠和人类肝组织公共领域的单细胞RNA测序数据。在小鼠和人类的肝脏中，观察到p21在不同细胞群中的广泛表达。值得注意的是，表达p16的细胞比表达p21的细胞更少，但它们在肝细胞群中阳性比例远低于表达p21的细胞。p16主要在非实质细胞（NPCs）中表达，包括T/NK细胞、B细胞、Kupffer细胞和内皮细胞，揭示p21和p16可能代表了人类和小鼠肝脏中两种不同类型的衰老细胞群。在小鼠和人肝脏的肝细胞中几乎没有检测到p16的表达。

利用ssGSEA算法对衰老相关信号通路在人类和小鼠肝脏中每类细胞群中的富集程度进行评分，发现p21+细胞群能有效富集RNA剪切、氧化应激、SASP分泌、与P21相关的因子分泌（PASP）等信号通路。分别分离老年p21-ATD小鼠及p16-3MR小鼠肝脏中的肝细胞以及非实质细胞，利用流式检测各自细胞群中tdTomato+衰老细胞的比例，进一步证明了肝脏衰老细胞的异质性，即衰老的肝细胞更倾向于表达p21，而p16更倾向于在衰老的肝脏非实细胞中表达。如下图：

图注：大多数衰老肝细胞表达 p21 而不是 p16

延胡索乙酸水解酶（FAH）的基因失活可引起肝脏有毒代谢物FAA的累积，NTBC药物摄入可防止诱导FAA的产生，因此通过控制NTBC给药可诱导Fah-/-小鼠急性或慢性肝衰竭。Fah-/-小鼠模型被广泛应用于肝干细胞和肝基因治疗的研究，课题组前期发现Fah-/-小鼠暴露于DNA损伤后，其血液中逐渐积累的毒素导致细胞周期阻滞和细胞增殖能力丧失，肝细胞发生衰老并为移植肝细胞的增殖提供选择性优势。

另外由于Fah-/-小鼠中基因缺失的肝细胞不能逆转恢复为正常肝细胞，可排除宿主来源细胞的影响，即可通过检测移植后小鼠肝脏中Fah酶的表达情况，进一步评估移植细胞的存活及再殖情况。由于此模型可很好的诱导肝细胞衰老并评估外源肝细胞在体内的增殖情况，因此我们将p21-ATD小鼠与Fah-/-小鼠杂交获得p21-ATD/Fah-/-小鼠，同时也将p16-3MR与Fah-/-小鼠杂交以获得p16-3MR/Fah-/-小鼠。诱导以上两种模型小鼠急性肝衰竭后，分别分离其肝实质和肝脏非实质细胞，流式分析tdTomato+细胞比例，进一步证明衰老肝细胞倾向于表达p21，而p16倾向于在肝脏衰老非实质细胞中表达。

团队从CAG-loxp-ZsGreen-Stop-loxp-tdTomato小鼠获得原代ZsGreen标记的肝细胞，并通过脾脏将其移植到p21-ATD/Fah-/-小鼠中。

实验设计为3组，p21-ATD/Fah-/-未处理肝细胞移植组；p21-ATD/Fah-/-急性肝损伤诱导衰老后肝细胞移植组；p21-ATD/Fah-/-急性肝损伤诱导衰老后肝细胞移植并经DT处理组。随后发现DT处理的移植组衰老肝细胞数量减少，外源肝细胞的定植与再殖比例显著升高。体现在外源肝细胞移植2周、5周时，DT处理移植组肝脏中p21+肝细胞数量减少，供体肝细胞的定植Fah阳性区域显著增加（活体检测肝脏部位ZsGreen荧光强度增加），同时增殖指标MCM2表达显著增多，且肝功能显著改善。

研究团队同时发现，DT处理后导致的宿主衰老肝细胞的清除，可有效降低肝脏中SASP因子CCL2的分泌，进而减少了巨噬细胞的募集，进一步提高了外源肝细胞的移植效率。如下图：

图注：肝损伤p21-ATD/Fah-/-小鼠衰老肝脏的体内成像和 ATD 基因表达

结论与讨论

综上所述，研究建立的p21-ATD小鼠模型可用于同时监测、分选和清除体内的p21+衰老细胞。体外和体内的多重衰老诱导实验证实了三个外源插入基因的有效功能，并发现清除老年p21-ATD小鼠p21+衰老细胞可有效改善其生理功能。联合p16-3MR衰老示踪小鼠模型进一步证明了肝脏衰老的异质性。将该模型与肝损伤Fah-/-小鼠模型杂交建立p21-ATD/Fah-/-小鼠后开展肝细胞移植研究，发现先诱导宿主肝细胞衰老为外源肝细胞提供再殖环境，再清除宿主衰老肝细胞为外源肝细胞提供再殖空间这样的两步走结合策略能有效促进外源肝细胞再殖效率。p21-ATD小鼠模型今后可广泛用于由衰老引起的慢性疾病的研究，并助力衰老细胞在分子生物学上的异质性以及生理功能等相关研究。

课题组介绍

何志颖理学博士、研究员、博士生导师

同济大学附属东方医院再生医学研究所执行所长，上海干细胞转化医学工程技术研究中心主任，兼任中国细胞生物学学会细胞治疗研究与应用分会秘书长、中国整形美容协会干细胞研究与应用分会副会长、中国解剖学会医学发育生物学分会副主任委员、中华医学会医学细胞生物学分会委员、上海生物工程学会理事、Cell Transplantation编委等学术任职。以干细胞转化医学、干细胞与肝脏再生及肝细胞衰老与肝癌发生机制为研究方向，研究成果发表在Nature, Cell Stem Cell, Cell Research, Gastroenterology, Hepatology, Molecular Therapy, npj Regenerative Medicine, Chemical Engineering Journal, Biomaterials, Matrix Biology, Clinical and Translational Medicine等国际期刊。主持国家重点研发计划“干细胞及转化研究”重点专项（首席科学家）、国家重点研发计划“发育编程及其代谢调节”重点专项PI、国家自然科学基金、上海市科委重大课题等30余项课题。研究成果被评为中国科学十大进展、细胞出版社中国年度论文、上海市优秀发明金奖、上海医学科技奖二等奖等。主持研发多个干细胞治疗新药临床注册研究或干细胞临床备案研究。

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课题组研究方向：1. 干细胞肝向分化、肝向重编程及肝干细胞生物学2. 干细胞基础与转化医学研究3. 肝细胞移植和人源化肝脏4. 肝衰竭、肝硬化等肝病的细胞治疗5. 肝细胞衰老与肝癌发生、肝癌衰老诱导治疗及血管浸润与早期肝癌转移的机制研究