斑马鱼行为篇㉘：浅析斑马鱼孤独症模型

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)是一种神经发育类障碍疾病，核心症状为社交缺陷和重复刻板行为。斑马鱼(Daniorerio，zebrafish)是一种杂食性小型热带淡水鱼，繁殖周期短，全年可产卵，一次交配可产卵300枚以上。斑马鱼在体外受精发育，且发育十分迅速，受精3d即可达到早期幼鱼阶段，3个月发育成熟，胚胎和早期幼鱼处于透明状态，便于染色、光学成像观察体内器官。斑马鱼模型已广泛应用于遗传学、发育生物学、神经生物学等领域研究中。已在小鼠、大鼠、猴、狗等模式动物中构建了ASD模型，但在啮齿动物和灵长类动物模型中扩大高通量药物筛选则存在很多困难，也不易用于胚胎研究。因斑马鱼具有试验周期短、胚胎透明、发育迅速，适用于小分子化合物及药物筛选等优点，斑马鱼ASD模型已广泛应用于科学研究中，在环境毒物、药物筛选、模拟人类疾病等方面有着良好的应用前景。CRISPR-cas9等新基因编辑技术的使用将会进一步激发斑马鱼模型在ASD机制或与ASD相关联疾病研究中的潜力，斑马鱼模型在神经发育障碍疾病研究中的角色不可或缺。从最初的药物诱导到通过基因编辑技术敲除或敲低风险基因诱导ASD模型，斑马鱼ASD模型的发展已渐趋成熟。

基因同源性

在生理和遗传学上，斑马鱼与人类具有相似的消化道、血管系统、大脑(皮层、杏仁核复合体、海马体、基底神经节)、免疫系统、神经系统和转录系统。在分子生物学上，大约有70%的斑马鱼基因和人类具有功能相似性，包括细胞信号通路中的一些分子和参与神经系统功能的基因，对比人类疾病，斑马鱼则有86%的基因与人类相关联。在神经解剖学上，斑马鱼与哺乳动物的中枢神经系统(central nervous system，CNS)与周围神经系统(peripheral nervous system，PNS)也具有相似性，使得斑马鱼可以作为研究各种人类疾病和发现筛选药物的良好模型。人类ASD中有858个风险基因，斑马鱼则拥有62%的同源基因，这对ASD的临床研究具有极大的价值。正因斑马鱼与人类具有如此高的基因同源性，给予斑马鱼ASD模型一定的遗传背景支持。

优异的生理特性

斑马鱼体型小且易于养殖，斑马鱼成鱼长3~5cm，其胚胎仅几毫米，这使得实验室中斑马鱼的饲养和维持所需要的成本低廉。斑马鱼是研究脊椎动物神经系统发展和人类疾病的一个极有价值的模型。斑马鱼初步阶段的神经元网络形成发生在受精后16h，2~3d后，次级阶段的神经元网络形成，参与调控斑马鱼的行为。斑马鱼胚胎在体外受精和发育，且其发育迅速，产卵量大，斑马鱼胚胎在受精后3d可以达到早期幼鱼阶段，3个月便生长发育成熟，在不换水和不喂食的情况下，胚胎可以存活大约7d，这些特征均利于实验操作和实验重复，节约了大量时间成本。斑马鱼胚胎及早期幼鱼是透明的，便于光学成像、染色和观察体内检查内部器官，遗传可操作性强。

成熟的行为学测试系统

斑马鱼胚胎在17hpf(hour past fertilization)时就已经可以进行自发的尾部鞭打运动，并在慢慢发育中对触摸做出反应，当胚胎成功孵化成幼鱼之后即可在水中游泳，并发展出许多运动习性。在幼鱼孵化后就可以进行捕食，捕食行为对动物的生存至关重要的同时，也是一种非常复杂的行为，涉及到视觉、认知识别和精细运动等，在生物实验中可以被用于筛选影响认知的药物。在5dpf(day past fertilization)时，斑马鱼幼鱼就开始表现出“趋触性”，当它们被放入到一个新环境中时，它们会避开中心区域并朝着边缘移动，斑马鱼的趋触性往往被用来衡量焦虑，靠边行为增加代表了更高的焦虑水平。在6dpf时斑马鱼开始出现“浅滩行为”，表现为许多斑马鱼开始聚集在一起形成浅滩或集群，这是斑马鱼为了觅食、躲避天敌或寻找配偶而做出的一种行为，这种社交行为可以被用作研究社交障碍的疾病。在斑马鱼ASD模型中已经有了许多成熟的行为学试验，如评估社会识别、互动和偏好、新奇寻求、求爱、抑制性回避、恐惧和焦虑反应、重复/刻板行为、癫痫发作和攻击等。ASD斑马鱼具有非常独特的优势，使其成为一种公认的毒理学生物模型，填补了体外模型和哺乳动物生物模型之间的空白，在国内外被广泛用于评估各种化合物的功能和毒性。

- 人类孤独症样行为与斑马鱼行为的对应关系 -

基因修饰模型

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pten基因突变模型

位于10号染色体上的磷酸酶和紧张素同源物编码基因(pten)，包括两个同源体ptena和ptenb，约20%伴有大头畸形的ASD患者发现pten种系突变，表明pten突变与大头畸形有关。pten-ASD患者的感知缺陷、语言发育迟缓比非pten-ASD患者更严重，额叶皮层也较薄。在敲除ptena或ptenb的斑马鱼中出现头部畸形，胚胎增生和营养不良及致死现象。磷酸肌醇3-激酶/AKT(PI3K-AKT)通路失调与过度生长有关，pten是该通路的抑制剂，调节mTOR信号传导。大头畸形与语言发育迟缓有关，斑马鱼的生长发育可能通过pten调节PI3K-AKT通路来调节，mTOR信号传导可能是通路中的关键因素。

2

fmr 1基因敲除模型

胚胎发育过程中fmr1基因突变导致脆性X染色体综合征(fragile X chromosome syndrome，FXS)，多动症、癫痫、ASD等。约5%的ASD患者存在fmr1基因突变，表现出焦虑、智力障碍等现象。7 dpf的斑马鱼胚胎敲低fmr1后表现出焦虑、易怒和认知障碍。敲除fmr1基因的斑马鱼颅面缺陷、中脑及后脑边界的形态改变、大脑中组织缺乏以及胚胎轴突缺陷。敲除了fmr1基因的成年斑马鱼多动，且抑制性回避学习受损，即记忆和学习缺陷。fmr1编码的脆性X智力迟钝蛋白(Fmrp)参与调节突触可塑性和神经系统，但其在神经系统发育早期中的作用未知，fmr1敲除斑马鱼所表现出的异常现象与Fmrp蛋白间是否存在某种联系需要更多的探索。

3

dyrk1α突变模型

dyrk1α编码双特异性酪氨酸-(Y)磷酸化调节激酶1A，参与调节脑大小。dyrk1α突变导致语言和运动障碍、小头畸形等ASD样行为。TALEN介导的基因组编辑在斑马鱼中敲除dyrk1α显示了与自闭症相关的社会障碍，包括脑畸形、社会凝聚力下降以及焦虑行为。dyrk1α-/-斑马鱼下丘脑转录表达降低，存在社交缺陷和小头畸形。小头畸形和社交障碍可能源于脑发育时期神经元细胞死亡，dyrk1α-/-斑马鱼下丘脑神经元激活减少，下丘脑重要神经分泌核团室旁核(PVN)调控情绪和社会互动行为，dyrk1α-/-斑马鱼的异常社会行为与室旁核存在怎样的关联未可知。

4

cntnap2基因突变模型

接触蛋白相关蛋白样2(contactin-associated protein-like2，cntnap2，也称caspr2)是细胞粘附蛋白Neurexin家族的一种神经元跨膜蛋白，在突触形成和调节中起作用。斑马鱼cntnap2a/b蛋白与人类cntnap2蛋白分别具有71%、65%的同源性，并具有相同功能域。双突变体cntnap2a/b斑马鱼在4dpf时前脑和小脑中的GABA能细胞显著减少，cntnap2缺失导致斑马鱼脑中抑制性神经元缺失，谷氨酸能和GABA能通路失调，但对ASD病理和神经系统的影响尚不清楚。

5

chd8基因突变模型

染色体结构域DNA解旋酶结合蛋白8(chromodomain helicaseDNA-binding protein8，chd8)是一种染色质结合蛋白，有2种亚型:chd8L，全长280kDa；chd8s(Duplin)，全长110kDa，由基因编辑技术产生的NH2末端染色体结构域蛋白。chd8功能缺失突变体已被定义为ASD亚型中的一种，chd8患者大头畸形，其中80%的患者都存在胃肠道疾病，目前尚不清楚chd8突变与胃肠道疾病的作用关系。吗啉代介导的chd8下调模型出现了头畸形，包括前脑/中脑扩张、胃肠动力障碍等，与人类ASD患者现象一致。chd8参与调节人类和斑马鱼大脑生长发育，广泛表达于人类皮层、海马、杏仁核及纹状体中。chd8mRNA在斑马鱼受精后1dpf富集于脑和脊髓中，3~4dpf转移至头部及肠道。神经嵴细胞(neural crest cell，NCC)从尾侧后脑转移到胃肠道形成肠神经元，肠神经元组成的肠神经系统(enteric nervous systerm，ENC)控制着胃肠道运动。chd8突变斑马鱼出现大头畸形、肠道系统失衡，包括NCC数量降低，肠道神经元受损。虽然chd8在ENC发育中的作用未知，但由此推测chd8突变患者的胃肠动力障碍(便秘、稀便或腹泻)可能是由于chd8缺失致使肠神经系统受损。

6

shank3基因敲除模型

shank3家族蛋白(shank1，shank2，shank3)是突触支架蛋白，在哺乳动物脑中几乎所有兴奋性谷氨酸能突触的突触后致密区表达。shank3基因编码的蛋白是一种位于突触后致密区的支架蛋白，shank3基因缺陷与ASD的发病密切相关。研究发现ASD中shank3基因点突变，在约1%的ASD患者中确定了shank3突变的因果作用。shank3同源基因在斑马鱼基因组中复制，并有两个同源基因shank3a和shank3b，shank3a更适合作为人类shank3的模型。斑马鱼中shank3a复制在18号染色体上，shank3b复制在4号染色体上。利用CRISPR/Cas9基因工程技术在斑马鱼中获得shank3b基因功能丧失突变体模型，且该突变在斑马鱼中稳定传播。在4~8dpf给予shank3-/-斑马鱼5μmol/L丙戊酸钠能改善其ASD行为，提示VPA的神经保护作用可能具有治疗ASD的作用。催产素对shank3-/-斑马鱼的ASD行为也具改善作用。

该模型有助于研究shank3功能缺失与ASD间的联系，为高通量筛选药物提供新的实验平台。成年期shank3b-/-斑马鱼表现出明显ASD样行为，包括社交异常和重复刻板行为。shank3a和shank3a在前脑、中脑和后脑的腹侧表达最明显，shank3b在体轴形成和最早神经元退出细胞周期并开始分化的发育阶段开始表达，前脑和中脑中也表达，且前脑腹侧表达水平最高。斑马鱼作为研究神经发育和进行药物筛选的模型的多功能性可能对未来人类shank3功能和ASD的研究有重大贡献。

7

mecp2基因突变模型

甲基-CPG结合蛋白2(mecp2)是一种转录因子，也是一种激活因子，参与突触维持、RNA剪切以及神经发育，如抑制神经前体细胞分化等作用。斑马鱼第一个mecp2缺失模型是通过N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变建立的，表现出行为及运动异常，如运动活力下降、触觉反应迟钝。mecp2在斑马鱼28dpf的中枢神经系统中表达，敲低mecp2后，胚胎尾侧初级运动神经元轴突分支异常增加，表明mecp2是斑马鱼胚胎神经环路形成的重要调控因子，对维持神经系统的正常功能，抑制mecp2可能会致使运动发育的神经调节紊乱。

8

syngap1基因突变模型

syngap1编码一种突触Ras-GTPase激活蛋白，参与介导NMDA受体激活的RAS信号级联，并在产前大脑区域高表达。斑马鱼的两个syngap1同源体(syngap1a和syngap1b)在神经系统发育早期都有表达，syngap1b在体轴形成和最早神经元退出细胞周期并开始分化的发育阶段就已表达。斑马鱼中，敲除syngap1a/b增加了中脑、后脑和脊髓中的细胞死亡，大脑形态改变。48hpf时，syngap1a在前脑、后脑背侧表达最明显，syngap1b则在后脑背侧、中脑视神经顶盖中表达。敲低syngap1b或shank3a或二者组合会破坏大脑形态，胚胎神经系统细胞死亡增加。syngap1和shank3在脊椎动物胚胎中、中枢神经系统中广泛表达，并在发育过程中向大脑区域逐渐富集，在突触发生前的脑形态发生早期阶段起关键作用。敲除syngap1b和shank3会导致中枢神经系统特异性细胞死亡和中脑和后脑区域的发育延迟，这可能导致过度兴奋行为。虽然斑马鱼为syngap1和shank3的未知发育作用提供了一个胚胎窗口，但syngap1和shank3在突触发生前的发育作用仍未知。斑马鱼模型上的发现支持了ASD基因突变可能影响新生儿阶段导致ASD病理的新兴观点，建立稳定的斑马鱼突变体来研究早期精神发育障碍的原因是至关重要的。

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arid1b基因突变模型

arid1b编码AT互作结构域1B蛋白，在β-catenin水平上通过细胞核中Brg1依赖机制抑制Wnt/β-catenin信号通路。ASD患者arid1b转录水平降低，生长迟缓，敲低arid1b斑马鱼胚胎生长迟缓，提示arid1b可能是生长的决定因素。CRISPR/Cas9敲除arid1b的斑马鱼成骨基因和软骨基因表达紊乱，与人类患者低于平均身高的情况一致，表明arid1b调节骨形成，也表明arid1b是生长发育障碍基因治疗的潜在靶点。

环境因素诱导的孤独症模型

药物引起的疾病是生物医学研究的一个重要领域，有毒有害环境也是诱导ASD的重要因素，环境毒素诱导的斑马鱼模型在ASD中的应用也越来越广泛。

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丙戊酸钠暴露诱导的模型

妊娠期接触毒素是导致ASD的一个重要原因，丙戊酸钠(sodium valproate，VPA)是由8个碳所组成的支链短链脂肪弱酸，属于丙酸衍生物的一种。1881年由Beverly S burton首次合成，自合成起一直被作为有机溶剂来使用。直到1963年，Meunier等人提出VPA具有抗惊厥作用。早期发育阶段暴露于VPA的斑马鱼存活率降低、早期运动活动下降，成年后表现出社交缺陷。

其他化合物诱导的模型

戊四唑(pentylenetetrazole，PTZ)可有效模拟斑马鱼ASD样行为，暴露在含PTZ水中的斑马鱼表现出刻板行为和癫痫发作。非竞争性谷氨酸N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂双唑西平(MK-801)诱导后的斑马鱼鱼群发育受损和攻击行为。急性尼古丁和急性乙醇都会降低鱼群行为。此外，D1受体拮抗剂SCH23390能降低斑马鱼AB品系的社会偏好。一些工厂污染物也会引起斑马鱼的ASD样行为，如工业石油中的原油水溶性组分和铅污染物，致使斑马鱼幼鱼的游泳模式改变、鱼群凝聚力降低、焦虑增加。

参考文献

1、Oxytocin protective effects on zebrafish larvae models of autism-like spectrum disorder.[J]. RahmatiHolasoo Hooman;Salek Maghsoudi Armin;Akbarzade Milad;Gholami Mahdi;Shadboorestan Amir;Vakhshiteh Faezeh;Armandeh Maryam;Hassani Shokoufeh.Iranian journal of basic medical sciences,2023

2、Loss of autism-candidate CHD8 perturbs neural crest development and intestinal homeostatic balance.[J]. Hayot Gaëlle;Massonot Mathieu;Keime Céline;Faure Elodie;Golzio Christelle.Life science alliance,2023

3、Avian models for brain mechanisms underlying altered social behavior in autism[J]. Csillag András;Ádám Ágota;Zachar Gergely.Frontiers in Physiology,2022

4、陆燕琴,尚鑫淼,向往,等.斑马鱼模型在孤独症谱系障碍研究中应用进展[J].生物技术,2024,34(01):126-133.

5、斑马鱼模型在心血管疾病中的应用研究[J]. 贾静;章康威;王敏娟;包永芬;魏明杰;单士刚;迟恒.湖北科技学院学报(医学版),2023(01)

6、斑马鱼模型在肝癌疾病及自噬中的应用进展[J]. 杨嘉仁;胡梦雨;张瑞;唐景峰.生物技术,2022(03)

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