产量达3.1g/L，江南大学罗玮团队开发新型工程菌株

2,5-二甲基吡嗪（2,5-DMP）是一种重要的医药中间体和风味化合物，广泛应用于制药领域及食品添加剂领域。目前 2,5-DMP 的合成主要采用传统的化学合成方法，但是化学合成法存在成本较高、伴随有毒副产物的生成及产品分离困难等缺点，对环境造成极大污染，也给其在食品领域的应用带来了很大的困难。

而生物合成技术相对温和环保，合成的产物是天然的，更容易被广大消费者所接受，因此，2,5-DMP 的生物合成技术也越来越受到众多风味化合物生产企业的关注。然而，目前所报道的生物合成方式主要是利用枯草芽孢杆菌和大肠杆菌进行合成。近几年，有少数研究者通过基因操控手段改造 2,5-DMP 生产菌株，但是其转化率仍然很低，远远达不到大规模工业生产水平。

近期，江南大学罗玮教授团队采用代谢工程新策略，通过 CRISPR-Cas9 基因编辑技术构建了能够在不需要诱导剂或抗生素的情况下产生高水平 2,5-DMP 的大肠杆菌菌株，为 2,5-DMP 的大规模生产奠定了良好的基础。目前，这项研究成果已经以“Metabolic Engineering of Escherichia coli for Production of 2,5- Dimethylpyrazine”为题发表在Journal of Agriculture and Food Chemistry上。

（来源：Journal of Agriculture and Food Chemistry）

烷基吡嗪是传统发酵和热处理食品中常见的芳香化合物，在食品工业中发挥越来越重要的作用。目前，化学合成是生产烷基吡嗪的主要方法，具有高能耗和危险等缺点。相比之下，生物合成过程具有可持续性和反应条件温和的优点。因此，微生物发酵法生产烷基吡嗪受到人们越来越多的关注。

2,5-DMP 属于烷基吡嗪的一种，可作为食品调味品，对食品风味有重要贡献。并且在制药领域也有重要的应用，如作为降糖药格列吡嗪和降脂药阿昔洛韦的合成底物。2,5-DMP 的生物合成近年来受到越来越多的关注，而目前报道的 2,5-DMP 工程菌株依靠重组质粒生产，产量低，不利于大规模发酵的稳定性。因此，有必要建立一个基因稳定的细胞工厂，更适合工业规模生产 2,5-DMP。

在这项研究中，江南大学罗玮教授团队通过对2,5-DMP 生物合成途径进行重构，以产 L -苏氨酸的野生菌株 E. coli TWF001 为起始菌株，依次敲除 TWF001 染色体上的 lacI 基因、KBL 基因和整合 SoAAO（氨基丙酮氧化酶）并经Ptrc驱动，产生三种菌株转化体系 D1-D3 进行 2,5-DMP 的产量对比。

随后，他们通过增强辅因子可用性提高目标产物的产量。TDH（2,5-DMP生物合成途径中的关键酶）是一种 NAD+依赖性酶，因此，提高 NAD+的可用性和有效性至关重要。罗玮教授团队通过增强 Preiss−Handler 通路（NAD+合成首选途径），增加了细胞内 NAD+含量。将 NAD+合成途径关键酶基因依次插入到 D3 基因组中负责 NAD+降解的基因位点上，获得菌株 D4 和 D5，进行 2,5-DMP 的累积量对比。然后，通过引入 NADH 氧化酶 SmNox 将 NADH 氧化为 NAD，实现 NAD+再生，进一步提高 NAD+的可得性。

此外，研究员们通过将具有反馈抑制抗性、可以编码天冬氨酸激酶（AK）调控 L-苏氨酸合成的基因进行整合和编辑，产生四种菌株转化体 D6-D9，对比其 2,5-DMP 和 L-苏氨酸的累积量，加强前体苏氨酸的供应。并采用PfliC启动子替代 lysA、metA 和 ilvA 的天然启动子，以动态调节赖氨酸、L-蛋氨酸和 L-异亮氨酸合成途径，增强固定阶段向 L-苏氨酸的碳流，进一步提高 L-苏氨酸的可用性。

接下来，他们通过促进 L-苏氨酸的生物转化和修饰 L-苏氨酸运输系统，平衡 L-苏氨酸的供应和转化。以 D9 为起始菌株，对 TDH 基因进行过表达，缓解 L-苏氨酸在胞外区域的积累问题，从而提高 2,5-DMP 的代谢通量。并以负责 L-苏氨酸运输的基因为后续的修饰靶点，调控 L-苏氨酸的摄取。通过增强 TDH 基因表达和修饰 L-苏氨酸转运系统相结合显著提高 2,5-DMP 的产量。

最后，研究员们对 2,5-DMP 补料分批发酵，记录细胞生长和 2,5-DMP 的产量，进一步评估多个菌株转化体系在更大规模上的特性，最终 D19 工程菌株的 2,5-DMP 产量高达 3.1 g/L，是目前以葡萄糖为碳源发酵生产 2,5-DMP 的最高滴度。

▲图 | 大肠杆菌生产 2,5- DMP 的代谢途径和策略（来源：Journal of Agriculture and Food Chemistry）

总的来说，这项研究构建了 2,5-DMP 的生物合成途径，实现了基于葡萄糖生产 2,5-DMP。通过提高辅助因子 NAD+和前体 L-苏氨酸的可用性来提高 2,5-DMP 的产量。并且通过优化染色体上关键基因 TDH 的拷贝数和修改 L-苏氨酸转运系统来平衡 L-苏氨酸的供应和转化。最终达到以葡萄糖为碳源发酵生产 2,5-DMP 的最高滴度。为 2,5-DMP 的大规模生产奠定了良好的基础。

这篇论文通讯作者罗玮是江南大学生物工程学院教授，长期从事工业微生物代谢工程和合成生物学、酶工程和蛋白质工程的研究。课题组目前研究方向如下：1）氨基酸及其衍生物的代谢工程和生物催化；2）基于合成生物技术的食品原料/化妆品原料/化工原料/药物中间体的生物制造；3）结合人工智能技术的酶/蛋白理性设计、表达和改造。

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