《食品科学》：江南大学毛健教授等：GC×GC-TOFMS结合化学计量学解析传统型半干黄酒的挥发性陈化标志物质

黄酒按产品风格可分为传统型黄酒、清爽型黄酒和特型黄酒，其中传统型半干黄酒是最为流行的黄酒产品类型，陈化是其关键工序，通常需要经过5 a以上的长期陶坛贮存。陈化期间陶坛内发生了酯化、美拉德和氧化等一系列物理化学反应，使黄酒的香气逐渐变得浓郁协调，不同陈化时间的黄酒风味差异很大，往往被赋予不同的价值。

化学计量学能够实 现全二维气相色谱技 术-飞行时间质谱 （GC×GC-TOFMS）大数据集的深度 挖掘，适合复杂体系的解析。因此，江南大学 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心的刘少璞、周志磊、毛健*等人采 用顶空固相微萃取- 全二维气相色谱技术-飞行时间质谱（HS-SPME-GC×GC-TOFMS）技术对传统型半干黄酒陈化过程中挥发性组分的变化进行解析，并采用化学计量学方法筛选出具有代表性的传统型半干黄酒陈化标志物质，以期为理解黄酒陈化过程、评估黄酒品质及酒龄鉴别提供科学依据。

1 不同年份传统型半干黄酒挥发性组分鉴定

采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS技术解析传统型半干黄酒的挥发性组分特征，不同年份传统型半干黄酒共鉴定出351 个挥发性化合物，包括醇类49 个、酸类21 个、酯类88 个、醛类29 个、酮类36 个、酚类11 个、呋喃类18 个、内酯类10 个、萜类15 个、芳香族化合物25 个、含氮化合物23 个、含硫化合物10 个和其他化合物16 个，其中有40 个主要化合物在中国黄酒中被首次鉴定，如表1所示。

如图1所示，15 a陈酒（1963 个，图1B）较1 a新酒（1197 个，图1A）具有更为丰富的挥发性组分。不同年份传统型半干黄酒中挥发性化合物的类别和数目统计如表2所示，1 a新酒和15 a陈酒分别鉴定出225 个和304 个化合物，后者约为前者的1.35 倍。黄酒的挥发性化合物总数随陈化时间延长整体呈上升趋势，说明长期陶坛陈化过程能够丰富黄酒的挥发性物质组成，与其他酒类挥发性组分陈化研究结论相似。有31 个化合物仅在高年份陈酒（15 a）样本中检出，如2,6-二乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-戊烯-2-酮、2-壬烯-4-酮、3-壬烯-2-酮和香草乙酮等，它们可能是在陈化过程中生成的物质，对高酒龄黄酒的风味可能具有特殊的贡献。随着陈化时间延长，酸类、酯类、醛类、酮类、呋喃类、内酯类和含氮化合物数量整体增加，酚类、萜烯及其衍生物类数量整体减少，醇类化合物的数量先减少后增加，这可能与酯化、美拉德和氧化等反应的发生有关。

2 传统型半干黄酒挥发性物质随陈化时间的变化规律

对所有样本进行缺失值过滤，删减后得到223 个化合物进行单变量分析。使用FDR对P值校正后的单因素ANOVA显示，其中有198 个化合物在陈化过程中含量发生显著变化，并对其进行Pearson相关性分析。结果显示，共有44 个不相关或弱相关的化合物（|r|=0～0.4）、47 个中等程度相关的化合物（|r|=0.4～0.6）、84 个强相关性的化合物（|r|=0.6～0.8）和23 个极强相关性的化合物（|r|=0.8～1）。初步筛选出107 个重要化合物，其同时满足缺失值小于20%、ANOVA显著及Pearson相关性较强（|r|＞0.6）3 个条件，包括醇类8 个、酸类12 个、酯类33 个、醛类11 个、酮类5 个、呋喃类10 个、酚类3 个、内酯2 个、萜烯2 个、芳香族7 个、含氮化合物6 个、含硫化合物3 个和其他化合物5 个。107 个化合物中有95 个化合物在陈化过程中含量显著增加，12 个化合物含量显著减少。油酸乙酯、戊二酸二乙酯和水杨酸乙酯等30 个酯类物质含量的增加可能与酯化反应有关，2-丙酰呋喃、5-甲基糠醛和5-羟甲基糠醛等呋喃类物质含量的增加可能与美拉德反应有关。此外，55 个化合物首次被发现在陈化过程中含量显著变化，按r值高低排序如表3所示。

3 基于无监督多变量分析的不同年份传统型半干黄酒挥发性组分特征

化学计量学中的多变量分析一般分为非监督和有监督2 种方式，非监督多变量分析通常用于数据的初步探索，主要方法包括PCA和聚类分析等。因此，对上述筛选出的107 个重要化合物进行PCA、HCA和K-means聚类分析，以探究不同年份传统型半干黄酒样本之间的相似性，结果如图2所示。PCA结果显示，PC1和PC2共解释了84.0%的总方差，得分图中不同年份黄酒样本组之间产生明显的分离，说明不同年份黄酒样本具有一定的差异（图2A）。HCA结果表明，黄酒样品被聚为三大类，第1类为1 a陈和3 a陈的黄酒，第2类为6、9 a陈和12 a陈的黄酒，第3类为15 a陈的黄酒（图2B）。同时使用K-means聚类算法（K=3）对HCA结果进行验证，聚类结果在图2A中以不同颜色和椭圆范围表示，结果显示K-means聚类情况与HCA相同。以上结果表明，传统型半干黄酒的长期陶坛陈化进程可大致分为3 个阶段，即短期陈化（1～3 a）、中期陈化（6～12 a）和长期陈化（15 a及以上）。

4 基于有监督多变量分析的传统型半干黄酒的陈化标志物质筛选

PLS-DA是一种有监督的多变量分析方法，可以用来筛选对于样品分类具有突出贡献的变量。使用上述筛选出的107 个重要化合物建立了PLS-DA模型，结果如图3所示。在得分图中可以观察到不同样本组之间的分离，说明PLS-DA模型可以区分不同年份的传统型半干黄酒（图3A）。PLS-DA模型载荷图可以评估导致样品组间差异的特定挥发性化合物，可以看出大量化合物与高年份样品组密切相关（图3B）。使用交叉验证和置换检验评估模型性能。k折交叉验证（k=7）结果显示，模型R 2X =0.964，R 2Y =0.977，Q 2 =0.890，表示该模型具有良好的鲁棒性和预测能力。置换检验（n=200）中R 2Y 和Q 2 的截距分别为0.575和-0.897，Q 2 截距＜0.05，说明PLS-DA模型没有过拟合（图3C）。

为探究PLS-DA模型中对区分不同样本组具有突出贡献的变量，计算它们投影中变量重要性（VIP）值，VIP值大于1且值越高说明该变量对区分样本组的贡献越大。图3D结果表明，共有37 个化合物的VIP值大于1，其VIP值和Pearson相关系数r值如表4所示，它们对不同陈化时间的区分具有重要贡献，是传统型半干黄酒的陈化标志物质。使用聚类热图表示37 个陈化标志物质的含量变化（图4），样本的层次聚类结果表示在上轴的树状图中，可以看出样本仍分为短期陈化、中期陈化和长期陈化3 大类，与2.3节实验结果一致。变量的层次聚类结果表示在左轴的树状图中，37 个陈化标志物质共分为两大类，第1类为在陈化过程中含量减少的12 个化合物，如土臭素、二苯基甲烷和苯乙醛二乙缩醛等。第2类为含量增加的25 个化合物，如2-糠醛缩二乙醇、2-丁基-2-辛烯醛和邻苯二甲醚等。

为进一步筛选最具代表性的陈化关键标志物质，以VIP＞1和Pearson相关系数|r|＞0.8（极强相关）为条件对上述37 个标志物质进行最终筛选，得到了10 个化合物作为传统型半干黄酒的陈化关键标志物质，包括6 个含量减少的物质（癸酸乙酯、2-戊基呋喃、丁酸异戊酯、丁酸乙酯、丁酸和2-糠醇）和4 个含量增加的物质（4-乙基苯酚、2-乙酰基-5-甲基呋喃、邻甲酚和5-甲基糠醛）。

传统型半干黄酒中有4 个呋喃类陈化关键标志物质，其中2-戊基呋喃具有坚果香，是酿酒原料蒸煮后的重要香气成分，黄酒的蒸饭工艺可能是其产生的原因，可作为新酿黄酒的标志物质。2-糠醇首次发现为黄酒陈化标志物质，其含量持续减少的原因可能有：1）参与乙基糠基醚（P＜0.001，r=0.514）的形成；2）在酸性条件下形成棕色的脂肪族糠醇低聚物，并可能进一步参与类黑精的形成；3）氧化反应形成2-糠醛（P＜0.05，r=0.500）。5-甲基糠醛和2-乙酰基-5-甲基呋喃具有焦糖与焙烤般的香气，它们在陈化过程中显著增加，可能与美拉德等非酶褐变反应有关。5-甲基糠醛已被证明为黄酒的陈化标志物质，而2-乙酰基-5-甲基呋喃是浓香型白酒的产地区分标志物质，本研究发现其同样为黄酒的陈化标志物质。

陈化关键标志物质中有3 个酯类物质，其中癸酸乙酯和丁酸乙酯被其他研究报道为酒龄标志物，在黄酒陈化过程中呈显著减少趋势。丁酸异戊酯在黄酒中报道极少，被证明是区分不同发酵方式桃红葡萄酒的标志物质，本研究首次证明其为黄酒陈化过程中显著减少的标志物质。

2 个酚类陈化关键标志物质的含量在陈化过程中增加，可能与黄酒中存在的对香豆酸和阿魏酸等羟基肉桂酸类物质的转化有关。邻甲酚是首次在中国黄酒中鉴定出的微量化合物，并在本研究中被证明是传统型半干黄酒的陈化标志物。

5 结 论

本研究采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS技术对不同年份传统型半干黄酒的挥发性组分进行全面解析，鉴定出了大量的微量挥发性化合物。陈化过程中挥发性物质总数呈增加趋势，其中107 种化合物含量发生显著变化且与陈化时间相关性较强。化学计量学分析发现传统型半干黄酒的陈化进程可以分为短期、中期和长期陈化3 个阶段。最终筛选得到37 个陈化标志物质，其中10 个为关键标志物质。丁酸异戊酯、丁酸、2-糠醇、2-乙酰基-5-甲基呋喃和邻甲酚5 种化合物首次被鉴定为黄酒陈化关键标志物质，它们在陶坛陈化期间的含量变化可能涉及水解、酯化、氧化和美拉德等多种反应，并可能受到温度和氧气等环境因素的影响，其含量变化机制及对黄酒陈化风味的影响值得进一步研究。

本文《GC×GC-TOFMS结合化学计量学解析传统型半干黄酒的挥发性陈化标志物质》来源于《食品科学》2023年44卷18期249-258页. 作者：刘少璞，周志磊，俞红波，茅来根，潘兴祥，姬中伟，毛健. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221128-318. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。