清华大学盛兴副教授团队最新Nature biomedical engineering

薄膜硅二极管用于激发和抑制神经活动

技术的进步推动了神经科学和神经系统疾病治疗的进展。在高时空分辨率下精确地刺激和/或抑制神经活动将有利于神经科学研究，并可产生临床影响。光遗传学方法，由于其高时空分辨率和最小的侵入性，用于精确的神经调控，具有高度的细胞特异性。各种光敏离子通道可以在细胞膜上表达，并允许在中枢和周围神经系统的细胞水平上进行光激活和抑制。最近，光诱导的物理刺激已被用于远程非遗传性的神经调控。基于光热的神经活动的激活和抑制被归因于可能的机制，即激活时的瞬时高温增加和抑制热相关离子通道时的相对缓慢的小温度增加。光电子过程在光电化学和/或光电容效应的基础上将光子转换成电流。光电子方法在体外和体内的神经兴奋能力已被研究过，但其在神经抑制方面的能力却很少被探讨。尽管电诱导的细胞去极化和超极化已经得到了很好的研究，但仍有必要开发光电技术来实现远程和精确的神经兴奋和抑制。

基于以上背景，清华大学盛兴副教授团队联合中国科学院先进技术研究院认知与脑疾病研究所李骁健教授和北京理工大学WangShirong副研究员提出了一种远程和非遗传性的光电策略，利用灵活和可生物吸收的硅膜，实现确定性的神经激发和抑制。具体来说，当薄膜与神经元接触时，薄膜硅基pn二极管产生光诱导的正电场和负电场，会导致光诱导的细胞去极化和超极化，以及细胞内钙离子动态的调节。此外，这些光电接口能够实现外围和中枢神经组织的选择性体内兴奋和抑制（取决于硅二极管的极性）并且，硅膜具有生物相容性，可在动物体内自然溶解。相关成果以“Bioresorbable thin-film silicon diodes for the optoelectronic excitation and inhibition of neural activities”为题发表在Nature biomedical engineering上。

水溶液中可调节的光电反应

图1a显示了一个柔性硅膜，其稳态光电压是由浸泡在磷酸盐缓冲盐水（PBS）的硅表面上的贴片吸管测量的。一束红色激光入射到样品表面，在不同的样品中诱导出强度依赖性的光电反应（图1b，c）。n+p和p+n二极管都对激光照射作出动态反应，并在溶液中呈现相反的光电压，其光诱导信号比相同厚度的纯p型和n型硅薄膜高得多。这些结果可以归因于pn结内的内置电位，它有效地分离了光生载流子，并导致阳离子或阴离子在Si/溶液界面的积累（图1d）。此外，值得注意的是，作者检查了图1b,c中与溶液接触的轻度掺杂表面，作者发现高掺杂区域在Si/溶液界面也表现出相对较弱的光电压。这可能是由于高掺杂的硅表面的接触障碍和带状弯曲阻碍了载流子的积累。

为了评估Si薄膜在水环境中的光电反应，作者通过逐步改变移液器和硅表面上的照明中心之间的垂直和横向距离，进一步量化了光电压的三维空间分布（图1e）。光伏信号被限制在照明点内，n+p和p+n Si的光电压随着与中心的距离z和x的增加而逐渐减少，在z=2 mm或x=2 mm左右时下降到最大值的~50%（图1f,g）。这些实验结果与通过有限元分析计算出的光电压分布相一致（图1h）。当涉及到诉诸光刺激的神经调节时，也有必要评估固/液界面的光热效应。通过在硅表面安装热电偶，作者绘制了发生在n+p和p+n硅上的最大温升，作为照明持续时间和光强度的函数（图1i）。

图1: 硅薄膜结及其在水溶液中的光电反应

光电对体外神经活动的激发和抑制

为了研究光伏效应对生物系统的影响，作者在p+n和n+p Si薄膜上培养了大鼠背根神经节（DRG）神经元，并使用全细胞贴片记录研究光诱导的细胞活动（图2a）。作者首先检查了在p+n Si、n+p Si和玻璃上培养的DRG的静息膜电位（RMPs），并记录了不同组细胞在黑暗环境中类似的平均RMPs，约为-50 mV（图2b）。随后，作者保持电位在-65 mV，并记录了不同强度的照明所引起的细胞膜电位的阈下变化（图2c,d）。显然，对p+n硅薄膜的连续照明提高了膜电位，导致细胞去极化。膜电压的变化与p+n硅膜产生的负光电压相一致，它积累了阳离子（图1b-d）。相反，n+p硅膜上类似的照明条件降低了膜电位，导致细胞超极化，这也可以用光电压引起的阴离子积累来解释（图1b-d）。作者还注意到，当n+p硅膜中的辐照度进一步增加（>2 W cm-2）时，膜电位从超极化倒转为去极化（图2c），并最终导致动作电位（AP）的发射。

作者通过将细胞膜电位保持在-45 mV来进一步检查光诱导的细胞活动。对于p+n硅片上的DRG，连续照明引起APs（图2e）。此外，当辐照度从0.6 W cm -2增加到2.1 W cm -2时，AP起始时间从3.5 s减少到0.6 s，尖峰频率从3 Hz增加到55 Hz（图2f，g）。与以前报道的DRG的神经元兴奋相比，这里应用的辐照度要低三或四个量级。图2c,d显示，照明的n+p硅薄膜可以使DRG神经元超极化，这表明可以用于抑制细胞活动。在图2h中，n+p Si薄膜上的DRG通过不断从移液管注入去极化电流而被激活，细胞APs随着辐照度的增加而逐渐减弱，在~1.5 W cm -2时得到完全抑制，持续时间长达60秒，这种长时间的抑制与照明的n+p Si薄膜的超极化效应相一致（图2c）。图2i,j中统计了强度依赖性的尖峰率抑制情况。

图2 用硅薄膜结对体外细胞活动进行光电激发和抑制的研究

为了大规模地验证光电刺激下的神经活动，作者对在硅片上培养的DRG进行动态钙成像（图3）。对于p+n Si上的DRG，荧光在光照时增加（图3a-c），增强的辐照度进一步提升了Ca 2+信号（图3d）。相反，对培养在n+p Si上的细胞应用光刺激会减少Ca 2+荧光，表明细胞活动受到了抑制（图3e-g）。光抑制作用随着辐照度的增加而加强（图3h）。

图3 通过薄膜p+n和n+p硅结在体外对细胞钙离子动态进行光学调制成像

体内外周神经活动的光电激发和抑制

作者将薄膜硅二极管应用于周围神经系统（PNS），特别是评估它们在坐骨神经的光激励和抑制方面的能力（图4）。作者研究了硅基二极管薄膜对野生型小鼠坐骨神经的光学调制效果，而不需要进行基因改造（图4）。硅薄膜二极管被转移到灵活的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）基片上，并保形地附着在暴露的坐骨神经上。入射到p+n硅片上的脉冲照明唤起了CMAPs并导致后肢抬起（图4b）。这种行为可以解释为，光激发的p+n Si薄膜在神经纤维中诱发了更多的正电荷，导致细胞去极化并诱发CMAPs（图4c）。此外，进一步提高辐照度（>1.5 W cm-2）可减少CMAPs和位移（图4d,e）。

硅二极管薄膜的一个更突出的特点是一个倒置的结构（n+p硅二极管）可以替代性地实现光诱导抑制。如图4f所示，神经中的光生负电荷可以阻断从近端到远端位置的正电荷信号传输，抑制CMAPs。在这个实验中，外部刺激电极在神经近端位置定期诱发后肢运动，连续的照明入射在神经上的n+p硅薄膜。在辐照度约为0.1-1.5W cm -2时，应用光刺激减少电诱发的CMAPs和位移，与照明前收集的平均数据相比，相对减少10-15%（图4g、h，）。相比之下，光照直接 相比之下，直接施加在神经上的照明（没有Si膜）并不引起明显的抑制作用。

图4 用p+n和n+p硅薄膜分别对体内的外周神经活动进行光电激发和抑制

体内皮质神经活动的光电激发和抑制

除了PNS，转移到柔性基底上的薄膜硅二极管也可以安装在动物的大脑皮层上，并通过其光电信号调节体内的大脑活动（图5）。图5a,b中示意，金涂层的硅薄膜附着在小鼠大脑的体感皮层上。一束激光入射到硅表面，一个线性微电极阵列斜插到薄膜下面的组织中以记录细胞外活动。自发和受刺激的尖峰状事件被分类，显示出典型的细胞外电生理记录（图5c）。图5d显示了通过照亮皮层上的p+n Si薄膜和相应的来自原始数据的量化光栅图的代表性电生理信号。八个通道的热图描述了皮层内部由p+n硅膜的光刺激引起的尖峰发射变化（图5e）。这些结果显示，强烈的刺激反应发生在浅层神经元。值得注意的发现是，通过扭转二极管的极性可以获得光抑制。图5f显示了在有n+p硅膜的情况下记录的典型数据，大脑活动最初由AMPA激活。被照亮的n+p硅片明显抑制了预先诱发的皮质活动（图5g）。

图5 用p+n和n+p硅薄膜分别对体内的大脑皮层活动进行光电激发和抑制

薄膜硅二极管的生物降解

硅基薄膜器件的另一个独特特点是它们在生物系统内的兼容性甚至可降解性。p+n和n+p硅薄膜在水溶液（0.1M PBS，pH7.4，37℃）中浸泡长达5个月，测量薄膜厚度和光反应的演变，分别显示在图6a，b中。p+n硅的平均溶解率为~2纳米/天，n+p硅的平均溶解率为~3纳米/天。伴随着薄膜的溶解，它们的光电压也急剧下降，在PBS中5个月后下降到原始值的~40%。同时，作者将Si薄膜包裹在小鼠的坐骨神经上（图6c），并将Si薄膜贴在小鼠的大脑皮层上（图6d），评估它们在体内的降解情况。这些硅膜在5个月后完全消失，与体外结果相比，显示了更快的降解。坐骨神经的组织学图像显示对组织的损害很小，与植入有关的免疫反应可忽略不计（图6e）。对植入硅的脑组织进行了元素分析，观察到溶解的硅的积累极少（图6f）。

图6 硅薄膜的体外和体内降解和生物相容性的研究

小结

作者目前的工作采用了平面p+n和n+p硅薄膜，这适合于在大面积上以毫米为单位调节神经细胞或组织。与最先进的光遗传学技术相比，这些平面硅片的空间分辨率受到其几何形状和光斑大小的限制，可以实现高细胞特异性的细胞水平调控。除了神经元，光电刺激还可以调节其他细胞的行为，如胶质细胞、心肌细胞、卵细胞和人类胚胎肾细胞。总之，作者在这里描述的材料和设备策略可以成为先进的光电生物界面，有可能用于基础生物研究和临床医学的应用。

来源：高分子科学前沿

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