FSHW：牛樟芝通过下调体外和体内黏附分子的表达抑制炎症细胞的浸润，改善新生内膜形成

Introduction

动脉粥样硬化、血管成形术后的再狭窄，以及冠状动脉搭桥手术后的移植动脉粥样硬化是发生在动脉内的病理过程，其中许多细胞类型，如巨噬细胞、内皮细胞（ECs）和血管平滑肌细胞（VSMCs），通过它们的相互作用，对各种内部或外部细胞刺激做出反应，引起慢性炎症。在动物模型中，单核细胞/巨噬细胞在动脉壁的浸润和细胞因子的产生被认为是调节动脉粥样硬化炎症的主要参与者，这与内膜生长有关，而通过降低细胞黏附分子的表达来阻断白细胞招募可以减少内膜增厚。因此，减少炎症细胞募集是修复血管损伤的一个主要问题。

先前研究表明，单核细胞/巨噬细胞浸润的最初步骤是由ECs驱动的。激活的ECs介导免疫细胞黏附到血管壁上，单核细胞渗透到内膜，从而引发炎症。最近的人体解剖研究、体外机制研究和体内相关数据强调了VSMC在保留单核细胞和巨噬细胞方面的重要作用，有助于血管炎症反应的启动和传播。与内皮细胞一样，VSMC也能产生多种黏附分子，如细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子（VCAM-1）和fractalkine（CX3CL1），促进单核细胞和淋巴细胞黏附并移入血管壁。此外，VSMCs还能够保护巨噬细胞免于凋亡。综上所述，VSMCs在血管炎症中占有重要地位。

牛樟芝（Antrodia cinnamomea，又名Antrodia camphorata、Ganoderma camphoratum或Taiwanofungus camphorata）是一种独特而珍贵的台湾地方药用菌菇。牛樟芝的成分包括三萜类、多糖、超氧化物歧化酶（SOD）、腺苷、琥珀酸和马来酸衍生物、蛋白质（包括免疫蛋白）、维生素、核酸、凝集素、麦角甾醇和木质素。其中，三萜类和多糖被认为是牛樟芝的主要保健功能来源。牛樟芝被广泛用作传统药物，用于治疗各种健康状况，如腹泻、解毒、保肝、腹痛、高血压、皮肤瘙痒和抗癌等，这与它的抗炎、抗氧化、抗病毒、抗过敏、抗微生物、免疫调节、抑制血小板聚集、保肝、抗疲劳等有关。然而，对牛樟芝在预防血管损伤和调节血管炎症方面的作用却知之甚少。 河北省食品检验研究院张岩、河北医科大学吕品、北京工商大学郑福平、河南大学康文艺等 在这项研究中发现，牛樟芝乙醇提取物（EEAC）可以防止结扎损伤诱发的新生内膜增生和核因子-κB（NF-κB）的激活，并对VSMCs和单核细胞/巨噬细胞中炎症细胞因子的表达有抑制作用。此外，EEAC处理能显著下调VSMCs中黏附分子的表达，随后降低巨噬细胞在体内和体外黏附VSMCs的能力。

Results

EEAC抑制了新生内膜增生的进展

为了研究EEAC在新生内膜形成中的作用，在颈动脉结扎后第14天收集小鼠颈动脉，观察到颈动脉的I/M厚度比增加（图1A）。与受伤的对照组相比，预给药50 mg/kg·day和100 mg/kg·day EEAC 1周，分别显著降低I/M厚度比超过55%和87%（图1A）。免疫组织化学染色显示，经EEAC预处理的动脉新生内膜VSMCs中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达被下调（图1B）。此外，实时荧光定量PCR和蛋白质印迹分析表明，在EEAC预处理的新生内膜动脉中，PCNA的表达明显下降，p21的表达增加（图1C，1D）。这些数据表明，EEAC对体内新生内膜增生和VSMC增殖有抑制作用。

A. H&E 染色（上）和I/M厚度比分析（下）；B.免疫组织化学分析PCNA表达；C.颈动脉中PCNA和p21 mRNA的RT-PCR；D.颈动脉中PCNA和p21表达的蛋白质印迹和光密度分析。

图1 EEAC抑制新生内膜增生的进展

EEAC抑制新生内膜增生期间NF-κB的激活

炎症是各种血管疾病期间新生内膜形成的关键反应，包括再狭窄、动脉粥样硬化和肺动脉高压。由于已知TNF-α可促进VSMC增殖，而炎症对细胞增殖具有重要影响，本研究试图确定EEAC抑制的新生内膜增生与TNF-α诱导的VSMC炎症之间的关系。炎症刺激后，转录因子NF-κB被激活，并在炎症反应中起主调控作用。因此，使用p-p65免疫组织化学染色，发现在损伤组中观察到p65的激活，且主要在VSMCs中，而EEAC的预处理几乎消除了p65的激活（图2A）。此外，研究评估了炎症分子的mRNA水平，包括iNOS、MCP-1、IL-6和IL-1β，发现EEAC给药后，这些炎症基因的表达水平下降（图2B～2E），表明EEAC可能有助于与血管疾病相关的抗炎活性。

A.颈动脉中活化p65表达的免疫组织化学分析；B.～E.颈动脉中促炎分子mRNA的RT-PCR。

图2 EEAC减弱了颈动脉中NF-κB的激活

EEAC减弱了体外VSMCs和巨噬细胞中的炎症细胞因子的表达水平

为了进一步研究EEAC是如何阻止血管炎症的，本研究转向培养VSMCs和巨噬细胞，这是炎症细胞因子的两个主要来源。首先，使用MTT试验检查了EEAC对TNF-α诱导的VSMCs细胞活力的影响。采用不同浓度（0～800 μg/mL）EEAC预处理VSMCs 24 h，然后TNF-α（10 ng/mL）刺激24 h。如MTT实验所示，TNF-α促进了VSMC的活力，而用400 μg/mL和800 μg/mL的EEAC预处理VSMCs 24 h，可剂量依赖地消除TNF-α对细胞活力的诱导作用（图3A）。为了进一步提供证据证明EEAC抑制VSMC活力与其抑制TNF-α诱导的炎症有关，研究了EEAC对炎症细胞因子表达水平的影响。蛋白质印迹分析显示，TNF-α引起VSMCs中p65的明显磷酸化（图3B）。用EEAC预处理VSMCs 24 h，大大减弱了TNF-α刺激组中p65的磷酸化（图3B）。接下来，检查了EEAC是否抑制了VSMCs中NF-κB靶向炎症细胞因子的表达水平。如图3C～3F所示，TNF-α增加了iNOS、MCP-1、IL-6和IL-1β的mRNA水平，在TNF-α刺激下，EEAC预处理24 h减少了这些炎症细胞因子的产生，而对它们在基础组的表达几乎没有影响。

A. MTT检测VSMCs活力；B. VSMCs中活化p65表达的蛋白质印迹和光密度分析；C.～F. VSMC中促炎分子mRNA的RT-PCR。

图3 EEAC抑制了NF-κB的激活和TNF-α刺激的VSMCs中促炎分子的表达水平

与VSMCs的实验平行，巨噬细胞的实验结果也显示，EEAC以浓度依赖的方式抑制TNF-α诱导的RAW264.7活力，在EEAC浓度为400 μg/mL和800 μg/mL时，观察到细胞活力的明显下降（图4A）。蛋白质印迹结果显示，TNF-α上调的p-p65表达在基础组和TNF-α刺激组都被EEAC所逆转（图4B）。qRT-PCR显示EEAC阻止了TNF-α诱导的iNOS、MCP-1、IL-6和IL-1β mRNA水平（图4C～4F）。总之，这些发现表明，EEAC通过抑制NF-κB信号通路抑制了TNF-α诱导的VSMCs和巨噬细胞的炎症。

A. MTT检测RAW264.7细胞活力；B. RAW264.7细胞中活化p65表达的蛋白质印迹和光密度分析；C.～F. RAW264.7细胞中促炎分子mRNA的RT-PCR。

图4 EEAC抑制TNF-α刺激的巨噬细胞中NF-κB的活化和促炎分子的表达水平

EEAC在体外通过降低VSMCs释放的黏附分子水平来抑制巨噬细胞对VSMCs的黏附

单核细胞/巨噬细胞与VSMCs的黏附是血管炎症的早期事件。通过体外黏附试验研究EEAC对TNF-α诱导的巨噬细胞和VSMCs之间相互作用的影响，在该试验中，钙黄绿素AM标记的RAW264.7细胞黏附在单层VSMCs上30 min，然后通过大力冲洗清除未黏附的巨噬细胞，并对黏附的RAW264.7细胞进行成像和计数。用TNF-α处理24 h后，巨噬细胞对VSMCs的基础黏附增加了2倍以上。与单独的TNF-α相比，EEAC预处理24 h可使细胞黏附力减少25%（图5A）。

VCAM-1和ICAM-1作为黏附分子在VSMCs上有很好的表征，在单核细胞和巨噬细胞的保留中被诱导。因此，测试了EEAC是否会影响它们在VSMCs的表达。如图5B和5C所示，相对于单独使用TNF-α，EEAC处理导致VCAM-1和ICAM-1 mRNA水平下降70%～80%。此外，在EEAC处理组中也观察到VCAM-1和ICAM-1蛋白水平的明显降低（图5C）。总之，这些数据表明，用EEAC预处理VSMCs，通过抑制VSMCs分泌的VCAM-1和ICAM-1的表达水平，减少了巨噬细胞和VSMCs之间的相互作用。

A.钙黄绿素AM标记的RAW264.7细胞黏附到VSMC的代表性图像和量化；B. VSMCs中黏附分子mRNA水平的RT-PCR；C.血管平滑肌细胞黏附分子蛋白表达水平的蛋白质印迹分析

图5 EEAC降低了巨噬细胞对VSMC的黏附

EEAC抑制了新生内膜增生过程中黏附分子的表达水平和炎症细胞的浸润

在体内验证了EEAC对黏附分子表达和炎症细胞浸润的影响。免疫组织化学染色显示，在用EEAC预处理的动脉新生内膜VSMCs中，VCAM-1、ICAM-1、CD14和CD68（单核细胞和巨噬细胞的制造商）的表达水平明显下降（图6）。这些结果进一步表明，EEAC对体内的血管炎症有抑制作用，并可能是预防血管成形术后再狭窄的有效药物。

图6 EEAC抑制颈动脉中黏附分子的表达和炎症细胞浸润

Conclusion

牛樟芝可以防止结扎损伤后的新生内膜增生和血管炎症，并在TNF-α刺激下对VSMCs和单核细胞/巨噬细胞表现出抗炎作用。这一过程与VSMCs中VCAM-1和ICAM-1的表达下调以及由此产生的巨噬细胞在体外和体内对VSMCs的黏附减少有关。

Antrodia cinnamomeaameliorates neointimal formation by inhibiting inflammatory cell infiltration through downregulation of adhesion molecule expressionin vitroandin vivo

Yan Zhanga,b,c, Aijin Maa, Hao Xib, Ning Chenb, Rong Wangb, Chenhui Yangb, Jinbang Chenb, Pin Lva,b,*, Fuping Zhenga,*, Wenyi Kangd,*

a Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China

b Cardiovascular Medical Science Center, Department of Cell Biology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050091, China

c Hebei Food Safety Key Laboratory, Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050091, China

d National R & D Center for Edible Fungus Processing Technology, Henan University, Kaifeng, Henan 475004, China

*Corresponding authors.

E-mail address: lvpin@hebmu.edu.cn

zhengfp@btbu.edu.cn

kangweny@hotmail.com

Abstract

The increased vascular inflammation is a key event in the development of atherosclerotic lesions. Antrodia cinnamomea has been shown to promote anticancerogenic activity through decreasing inflammation. However, the potential role of A. cinnamomea in cardiovascular diseases remains unexplored. Herein, using carotid arterial ligation models, we found that ethanol extract from A. cinnamomea (EEAC) significantly inhibited neointimal hyperplasia in a dose-dependent manner, accompanied with the reduced expression of activated p65 and inflammatory cytokines. We also show that EEAC ameliorated TNF-α-induced phosphorylation of p65 and pro-inflammatory cytokine expression in both vascular smooth muscle cells (VSMCs) and macrophages in vitro. Mechanistically, EEAC suppressed expression levels of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) in VSMCs, which attenuates the ability of monocytes/macrophages adhesion to VSMCs. Furthermore, the expression level of these adhesion molecules and infiltration of monocytes/macrophages were also decreased in neointimal VSMCs of arteries pretreated with EEAC. Altogether, our results reveal a novel function of A. cinnamomea in suppressing vascular inflammation upon ligation injury during neointimal formation, likely through inhibition of inflammatory cell infiltration via downregulating the adhesion molecules in VSMCs. Thus, A. cinnamomea may offer a pharmacological therapy to slow down disease progression in patients with vascular injury.

Reference:

ZHANG Y, MA A J, XI H, et al. Antrodia cinnamomea ameliorates neointimal formation by inhibiting inflammatory cell infiltration through downregulation of adhesion molecule expression in vitro and in vivo[J]. Food Science and Human Wellness, 2021, 10(4): 421-430. DOI:10.1016/j.fshw.2021.04.004.

翻译/编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

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