木犀草素及其黄酮苷的抗炎、抗氧化作用

　　木犀草素（lut）是一类典型C6-C3-C6结构的黄酮类化合物，广泛存在于抗炎植物原料中。木犀草素通常以黄酮苷形式存在，如黄酮氧苷结构的木犀草苷（cyn），以及黄酮碳苷结构的荭草素（ori）与异荭草素（homo）。木犀草素及其黄酮苷具有广泛生理活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抑制肥胖、缓解II型糖尿病等。而抗炎、抗氧化活性是黄酮类化合物发挥抗肿瘤、抑制肥胖、II型糖尿病等生理活性的基础。黄酮类化合物发挥抗炎活性的主要场所在免疫细胞（其中主要是巨噬细胞），黄酮类化合物对巨噬细胞炎性反应的抑制活性可通过抑制核转录因子κB（NF-κB）信号通路实现。黄酮类化合物在不同水平抑制NF-κB信号通路下调炎症介质的产生。

　　研究表明木犀草素及其黄酮苷具有较好的抗炎和抗氧化活性，然而，木犀草素及其黄酮苷能否在发挥抗炎活性的同时发挥抗氧化活性，其抗炎、抗氧化活性的两条主要信号通路之间是否存在交叉作用尚鲜见报道。因此，武汉食品化妆品检验所的王伟、何平和江小明*基于人源巨噬细胞THP-1，从分子水平探究木犀草素及其黄酮苷抑制NF-κB信号通路而发挥的抗炎作用，及对Nrf2转录活性的激活作用，解析木犀草素及其黄酮苷的抗炎作用、抗氧化活性及作用机制，为开发天然来源的抗炎、抗氧化活性成分提供依据，为木犀草素作为天然抗氧化剂的拓展应用提供指导。

　　1 黄酮类化合物对TPH-1单核巨噬细胞的毒性作用

　　结果显示，在作用浓度下，与CK组对比，5 μmol/L的黄酮类化合物对THP-1单核巨噬细胞无细胞毒性作用（P＞0.05）。Bay-11-7082是NF-κB抑制剂，其推荐使用浓度为10 μmol/L左右，因此，实验时，对10 μmol/L的Bay抑制剂细胞毒性进行评价，10 μmol/L的Bay抑制剂对THP-1单核巨噬细胞无细胞毒害作用。

　　2 黄酮类化合物对THP-1单核巨噬细胞炎性模型细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平的影响

　　在本实验中，经过LPS刺激后，THP-1单核巨噬细胞内TNF-α mRNA（图1a）和上清液中TNF-α（图1b）的含量极显著上升（P＜0.01）。与LPS刺激组相比，木犀草素及NF-κB抑制剂Bay均可显著降低细胞内TNF-α mRNA和上清液中TNF-α的表达，同Bay抑制剂类似，木犀草素可通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎活性，且5 μmol/L的木犀草素对TNF-α的抑制作用与10 μmol/L抑制剂Bay的抑制作用相当（P＞0.05）。木犀草苷、荭草素、异荭草素均可显著降低细胞中上清液中TNF-α的表达（图1b）（P＜0.05，P＜0.01）。

　　IL-6是一种多效性的促炎因子。如图2所示，经过LPS刺激后，THP-1单核巨噬细胞上清液中IL-6浓度极显著上升（P＜0.01），木犀草素和Bay均可极显著抑制细胞内IL-6 mRNA和上清液中IL-6的表达（P＜0.01），且木犀草素对IL-6的抑制作用与抑制剂Bay相当（P＞0.05）。木犀草苷、荭草素、异荭草素均可极显著降低细胞中上清液中IL-6的表达（P＜0.01）。

　　IL-1β是IL-1的主要成分，是一种多功能的炎症因子，主要表现在致炎和对组织的胶原降解的破坏作用。如图3所示，LPS作用于THP-1单核巨噬细胞后，胞内IL-1β浓度极显著增高（P＜0.01）。木犀草素及其黄酮苷对IL-1β的抑制作用较其对TNF-α和IL-6的弱，木犀草素对细胞内IL-1β mRNA的表达具有显著抑制作用（P＜0.05），荭草素对细胞上清液液中IL-1β表现出显著抑制作用（P＜0.05）。

　　3 黄酮类化合物对THP-1单核巨噬细胞炎性模型P-IκBα、P-IKKβ信号通路的调控作用

　　由图4可见，阳性对照组NF-κB抑制剂Bay的预处理可以抑制IκBα和IKKβ发生磷酸化，降低P-IκBα和P-IKKβ的含量。木犀草素、木犀草苷、荭草素、异荭草素均可以下调细胞中P-IκBα和P-IKKβ的产生，木犀草素及其黄酮苷对于抑制IκBα和IKKβ发生磷酸化具有较好的作用。

　　4 黄酮类化合物对THP-1单核巨噬细胞炎性模型中P65调控作用

　　同样通过计算相对比率分析抑制剂及黄酮类化合物对LPS刺激下THP-1单核巨噬细胞核和细胞质中P65的影响。LPS作用30 min后，细胞核和细胞质中P65较大程度地增加（图5）。阳性对照组NF-κB抑制剂Bay的预处理抑制了P65的生成，同时抑制了P65含量的核移位，这可以直接抑制NF-κB核转录因子调控的炎性介质的表达。木犀草苷、荭草素和异荭草素也可以通过抑制P65入核而发挥抗炎活性。

　　5 黄酮类化合物对THP-1单核巨噬细胞炎性模型中Nrf2和HO-1的调控作用

　　LPS刺激后，较CK组相比，细胞中总Nrf2表达量降低，细胞核中Nrf2相对含量显著减少，而细胞质中Nrf2相对含量显著增多，表明LPS诱导的炎性反应中，Nrf2发生核移位程度低，LPS刺激THP-1单核巨噬细胞建立的炎性细胞中细胞内源Keap1-Nrf2抗氧化系统受到一定程度抑制。

　　Bay-11-7082作为NF-κB抑制剂可以显著提高细胞中Nrf2的表达，但不能使表达的Nrf2进入细胞核，启动抗氧化系统，发挥抗氧化活性。而荭草素不仅可以显著促进细胞中Nrf2的表达，还可以显著促进Nrf2发生核移位；木犀草苷、异荭草素同Bay类似，仅可促进Nrf2的表达（P＜0.01）。

　　LPS增强了细胞内产生氧化应激反应，为增强细胞内抗氧化活性，HO-1表达增多（P＜0.01）。在作用12 h后，荭草素中HO-1表达量处于较低水平，可能是由于其通过显著促进细胞中Nrf2的表达，显著促进Nrf2发生核移位（图6c、e），黄酮类化合物发挥了一定的抗氧化活性，细胞内氧化水平已经得到控制（图7b），因而细胞内HO-1表达处于较低水平；木犀草素、木犀草苷、异荭草素3 种黄酮类化合物对HO-1的表达具有下调作用，这可能是经过黄酮类化合物的预处理后，抑制了IκBα和IKKβ发生磷酸化反应，直接抑制了NE-κB信号通路，较强程度上抑制了细胞内炎性反应（图6），细胞氧化应激水平不高，HO-1表达量较低。

　　结 论

　　木犀草素及其黄酮苷具有较好的抗炎活性，其中黄酮碳苷荭草素可以通过抑制NF-κB信号通路关键调控蛋白上游调控器P-IKKβ、上游调控蛋白IκBα的活性及下游调控蛋白P65的活性，下调细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β，发挥较强的抗炎活性；同时荭草素通过促进Nrf2核转录因子的表达和核移位发挥较好的抗氧化活性，IKKβ可能是荭草素抑制NF-κB信号通路并激活Nrf2发挥抗炎/抗氧化双重生物活性的交叉靶点；荭草素较木犀草素发挥了更强的抗炎、抗氧化活性，原因可能是其较木犀草素具有更低的代谢速率和更高的生物利用度。

　　本文《木犀草素及其黄酮苷的抗炎、抗氧化作用》来源于《食品科学》2020年41卷17期208-215页，作者：王伟，何平，江小明。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190908-103。

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