酱香型白酒1轮次酿造细菌的菌群结构

酱香型白酒作为典型的传统固态发酵食品，酿造历史悠久，深受世界人民尤其是东亚国家消费者的喜爱。其酿造工艺特点可概括为高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温流酒，生产周期长、贮存时间长，用曲量大，多轮次取酒。

堆积发酵是酱香白酒酿造的独特关键工序，属于边糖化边发酵方式，通过堆积发酵可显著富集微生物和酶类，生成酱香或酱香前体物质，为入窖发酵创造条件，相当于“二次制曲”，也是完成入窖发酵前的糖化基础。细菌及细菌代谢产物在高温堆积发酵过程的富集为形成后期窖池发酵的发酵动力和风味动力奠定了基础。堆积发酵结束后，酒醅入窖池发酵，窖池发酵阶段微生物菌群结构继续推进发酵，并进一步促进酱香风味化合物的增加。因此，堆积和窖池发酵的细菌菌群结构及其变化对产酒和生香具有举足轻重的作用，而研究酱香型白酒发酵过程细菌菌群结构是解析发酵机理和风味形成的关键，近年引起很多研究人员的关注。

无论在堆积发酵还是窖内发酵过程，酱香风味都主要来源于多种微生物的共同作用，其中细菌的贡献尤其重要。基于此，本课题组多年来一直聚焦于酱香型白酒酿造微生物多样性及其生态结构的研究，运用高通量测序技术等多组学策略对酱香型白酒酿造的全轮次（1～7轮次）微生物菌群结构特征进行系统研究。贵州大学酿酒与食品工程学院、贵州省发酵工程与生物制药重点实验室的胡小霞、黄永光*和贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司的涂华彬等人将1轮次堆积和窖池发酵过程的细菌菌群结构进行归纳总结，以期为传统白酒固态发酵机制及产业发展提供借鉴和参考。

1 α多样性分析

通过USEARCH将标签分组成具有97%相似性的OTU。计算Chao指数和ACE指数（以确定物种丰富度）、Shannon指数和Simpson指数（以确定物种多样性）及检测到的物种数目，以描述堆积、窖池发酵酒醅样品中的细菌菌群多样性，其分析测序指数结果显示，97%水平下共得到OTU数为122，堆积发酵结束即窖池发酵开始时OTU数最高，为102。酒醅样品的Shannon指数和Simpson指数表明，堆积发酵酒醅的细菌多样性和丰富度明显高于窖池发酵酒醅。并且在堆积过程中，随着堆积时间的延长，样品的细菌多样性呈现下降趋势。而在窖池发酵过程中，窖池发酵0 d的丰富度指数和多样性指数最高，窖池发酵开始后，细菌多样性和丰富度急剧大幅下降。所有样品的Coverage指数均大于0.999，说明各采样酒醅样品文库的覆盖率足够大，样品中的序列基本被全部测出，测序结果可体现酒醅样品细菌群落多样性的真实情况。

2 细菌菌群结构多样性

2.1 基于门水平的细菌菌群结构多样性分析

酱香型白酒1轮次堆积和窖池发酵过程不同样本序列经RDP classifier软件进行分类分析，在门水平上，其各样本的细菌群落结构组成如图2所示。从酱香型白酒1轮次堆积和窖池发酵酒醅中共检测到8 个门。从堆积发酵酒醅中检测到厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、蓝细菌（Cyanobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）8 个门；从窖池发酵酒醅中检测到除Deinococcus-Thermus外的其他7 个门，而在入窖池发酵后5～35 d中共检出Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimonadetes 5 个门（图2）。

在门水平，堆积发酵优势细菌（平均相对丰度大于1%）为Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria，其中Firmicutes和Proteobacteria占主导地位（平均相对丰度大于10%），平均相对丰度分别为75.58%和21.53%。窖池发酵酒醅中优势细菌为Firmicutes和Proteobacteria，Firmicutes占绝对主导地位（平均相对丰度为98.01%）；在堆积发酵结束即窖池发酵开始时，Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes平均相对丰度大于1%。窖池发酵开始后，Proteobacteria的相对丰度由12.42%（窖池发酵0 d）急剧下降至0.01%（窖池发酵5 d）以下，直至窖池发酵结束时相对丰度也不超过0.06%；Bacteroidetes则从2.91%下降并一直维持在0.01%以下。从窖池发酵的5～35 d，平均相对丰度大于1%的菌门仅有Firmicutes。

2.2 基于属水平的细菌菌群结构多样性分析

在属水平上，从酱香型白酒1轮次堆积和窖池发酵酒醅中共检出71 个属，图3为平均相对丰度至少在一个酒醅样品中大于1%的菌群结构。从堆积和窖池发酵酒醅中分别检出69 个和63 个属，堆积发酵结束即窖池发酵开始检出61 个属。窖池发酵0～5 d，有47 个属的相对丰度大幅下降至低于检出限，Lactobacillus相对丰度从79.42%上升至99.96%，成为主要菌群，从而也导致发酵酒醅酸度升高（从0.65 mmol/10 g上升至1.43 mmol/10 g）。上述47 个菌属含量大幅下降可能源于发酵环境改变或者Lactobacillus对其生物性抑制所致。窖池发酵5～35 d，新检出19 个属，其中梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_1）和g__unclassified_f__Peptostreptococcaceae 2 个属在堆积发酵酒醅中未检出，该两种菌属属于专性厌氧菌，适宜于厌氧发酵环境。气球菌属（Aerococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、嗜热杆菌（Thermus）、Xylella及3 个未分类菌属则只出现在堆积发酵中。这8 种菌属在堆积酒醅样品中平均相对丰度和占0.13%。

在属水平，堆积发酵优势细菌属有13 个，分别为Lactobacillus、Escherichia-Shigella、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Thermoactinomyces、Pediococcus、Acetobacter、Oceanobacillus、Acinetobacter、Lactococcus和糖多孢菌属（Saccharopolyspora），其中Lactobacillus、Escherichia-Shigella和Bacillus占主导地位，平均相对丰度分别为35.93%、12.19%和11.63%。本研究结论再次证实了上述研究者的结果：Lactobacillus、Escherichia-Shigella、Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus、Acetobacter、Acinetobacter、Lactococcus是酱香白酒第1轮次酒醅堆积发酵的优势菌属，同时本研究还新发现Lentibacillus、Kroppenstedtia、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Oceanobacillus、Saccharopolyspora也是酱香型白酒第1轮次酒醅堆积发酵的优势细菌属。酱香型白酒酿造第1轮次和第2轮次发酵酒醅的优势细菌属相比，Lactobacillus、Bacillus、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Oceanobacillus、Lactococcus是2 个轮次堆积发酵酒醅中共有的优势细菌属；而Lactobacillus则在2个轮次窖池发酵酒醅中均占绝对主导地位。

13 个优势细菌属中，Escherichia-Shigella、Thermoactinomyces、Lentibacillus、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Pediococcus、Oceanobacillus、Lactococcus和Saccharopolyspora 8个属随发酵时间的延长其丰度总体呈下降趋势，且在堆积发酵结束时相对丰度小于1%；Bacillus同样随着发酵时间延长相对丰度下降，但在堆积发酵结束时其相对丰度大于1%。这些优势微生物相对丰度下降与发酵过程中营养物质消耗（如淀粉质量分数从DJ 1 d的34.52%下降至DJ 7 d的29.84%）、微生物代谢产物累积导致发酵环境改变（如酸度从DJ 1 d的0.61 mmol/10 g上升至DJ 7 d的0.65 mmol/10 g）和微生物之间的相互作用相关。窖池发酵酒醅中平均相对丰度超过1%的菌属只有Lactobacillus，平均相对丰度占79.42%，该菌属在窖池发酵中也占绝对主导地位。窖池发酵开始时（即堆积发酵结束），优势细菌属有Lactobacillus、Acinetobacter、丛毛单胞菌属（Comamonas）、Acetobacter、Kroppenstedtia和Bacillus。窖池发酵开始后，除Lactobacillus相对丰度从79.42%急剧上升至99.96%并维持在99.84%～99.96%之间，其余5个菌属相对丰度均从大于1%急剧下降至0.04%以下，发酵窖池的菌群结构由多菌种演替为单一的Lactobacillus为主导。

Kroppenstedtia属于高温放线菌科（Thermoactinomycetaceae），Thermoactinomycetaceae多数在高温下生长，是高温大曲和酱香型白酒堆积酒醅中的优势菌。Bacillus是酱香型白酒生产过程中的主要功能菌。菌群检出结果表明，窖池发酵开始后，Lactobacillus含量急剧上升，Acinetobacter、Comamonas、Acetobacter、Kroppenstedtia和Bacillus含量急剧下降。进入窖池发酵，微生物生态从好氧及兼氧环境转入厌氧环境，大量厌氧微生物开始代谢产酸等，导致发酵酒醅环境酸度升高，乳酸菌耐酸性好，其含量随之上升，占绝对优势地位，并代谢产生大量乳酸，更致使酒醅环境pH值显著降低，进而抑制其他微生物的生长，同时也通过产生的抑菌素（如Nisin、lactacin、pediocin）抑制革兰氏阳性细菌的生长繁殖。革兰氏阳性菌Kroppenstedtia和Bacillus生物量的降低也说明其生态调控机制。Comamonas只在DJ 7 d（FJ 0 d）时相对丰度较大（3.26%），在其余样品中均小于0.01%，关于此菌，还有待进一步研究。

堆积发酵和窖池发酵是酱香型白酒酿造过程中两个不同的发酵体系，因发酵场和物态、生态上差异较大，所以两种发酵体系中的细菌菌群结构会存在明显的差异。又由于堆积发酵和窖池发酵是一个连续的工艺体系，所以在堆积和窖池整个发酵过程有87.5%的细菌门和85.92%的细菌属同时出现在两个阶段，这些微生物从堆积发酵迁移到窖池发酵。随发酵时间延长，发酵环境参数发生改变，微生物的分布也发生了变化，堆积发酵结束即窖池发酵开始是这些共有微生物迁移、发酵的过渡期。

3 相关性网络分析

为进一步研究上述主要微生物之间的相互关系，选取属水平总丰度前25的物种，并计算物种之间的斯皮尔曼等级相关系数，对其进行物种之间的相关性分析，结果如图4所示。

堆积和窖池发酵酒醅细菌菌群之间的相关性结果（图4）表明，多数微生物菌属之间呈显著正相关调节机制。堆积发酵中有8 个菌属间呈显著负相关，54 个菌属间呈显著正相关。而窖池发酵中有3 个菌属间呈显著负相关，85 个菌属间呈显著正相关。这些相互生物学关系构成了发酵过程的基本生物学调控机制，也是发酵过程发酵动力、风味动力形成和调控机制的基本组成。

从堆积发酵酒醅细菌菌群的相关性网络（图4A）中发现Lactobacillus一个负相关Hub（这里指至少与其他8 个属的微生物存在负相关性的节点）。Lactobacillus和Enterococcus、Pediococcus、多孢放线菌属（Actinopolyspora）、Saccharopolyspora、Streptococcus、Lactococcus、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Staphylococcus之间呈显著负相关性。这8 种菌属在堆积发酵过程含量全部呈现下降态势，堆积发酵结束时，相对丰度均小于1%。堆积发酵过程，Lactobacillus含量逐渐上升，从DJ 0 d的7.30%上升到FJ 0 d的79.42%，为堆积发酵的优势菌属。Enterococcus、Pediococcus、Actinopolyspora、Lactococcus、Saccharopolyspora、Streptococcus、Staphylococcus、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae 8 个菌属之间两两显著正相关，是网络图谱中的正相关Hubs（这里指至少与其他6 个属的微生物存在正相关性节点）。Escherichia-Shigella、g__unclassified_o__Bacillales、Bacillus、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Weissella、Lentibacillus 7 个菌属之间，除EscherichiaShigella和Bacillus相关性不显著外，其余全部都两两显著正相关，g__unclassifified_o__Bacillales、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Weissella、Lentibacillus也是网络图谱中的正相关Hubs，这5 种菌属相对丰度含量总体呈下降趋势。

从窖池发酵酒醅细菌菌群相关性网络（图4 B）中发现存在14 个正相关Hubs，分别为Bacteroidetes下的稳杆菌属（Empedobacter）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）、鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）、Myroides、黄杆菌属（Flavobacterium）、Proteobacteria下的葡糖杆菌属（Gluconobacter）、Pseudochrobactrum、普罗威登斯菌属（Providencia）、Comamonas、Stenotrophomonas、Defluviimonas，Firmicutes下的Lentibacillus、Oceanobacillus，Actinobacteria下的Corynebacterium_1。仅有Lactobacillus和Thermoactinomyces、Pediococcus、Pediococcus和g__unclassified_f__Peptostreptococcaceae之间呈显著负相关。

在堆积发酵过程，Lactobacillus与8 个正相关Hubs呈现显著负相关机制，而在窖池发酵过程中，Lactobacillus仅与Thermoactinomyces和Pediococcus显著负相关，Thermoactinomyces和Pediococcus节点连通性都不是很高，说明在堆积发酵阶段Lactobacillus对其他微生物的抑制作用强于窖池发酵阶段，且Lactobacillus在窖池发酵过程中含量比堆积发酵过程多，由此可推断，窖池发酵过程中微生物种类较少，以及除Lactobacillus以外的其他微生物含量很低的主要原因并不在于Lactobacillus对其他微生物的生物学抑制作用，其真正的内在调节机制本课题组正在开展进一步的研究论证。

结 论

酱香型白酒1轮次堆积发酵过程细菌的多样性和丰富度明显高于窖池酒醅，随着堆积发酵时间的延长，细菌多样性呈现下降趋势；随着窖池发酵开始，细菌的多样性和丰富度呈现急剧大幅下降。在门和属水平上，堆积发酵检出的总细菌、主要细菌和优势细菌种类均比窖池发酵同比数据多。从酱香型白酒1轮次堆积和窖池发酵过程一共检出8 个门，71 个属。从堆积发酵酒醅中检出8 个门，69 个属；从窖池发酵酒醅中检出7 个门，63 个属。堆积发酵优势细菌门为Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria，其中Firmicutes和Proteobacteria占主导地位；优势细菌属有Lactobacillus、EscherichiaShigella、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、g__unclassified_f__Enterobacteriaceae、Thermoactinomyces、Pediococcus、Acetobacter、Oceanobacillus、Acinetobacter、Lactococcus和Saccharopolyspora 13 个，其中Lactobacillus、Escherichia-Shigella和Bacillus占主导地位。窖池发酵酒醅中优势细菌门为Firmicutes和Proteobacteria，Firmicutes占绝对主导地位。窖池发酵优势细菌属是Lactobacillus，其占绝对主导地位。

细菌菌群结构相关性调节机制上绝大多数菌属之间呈显著正相关性机制，这种机制对堆积和窖池发酵过程稳定的菌群形成具有重要调控作用。堆积发酵过程存在Enterococcus、Pediococcus和Actinopolyspora等13 个正相关Hubs，Lactobacillus 1 个负相关Hub；窖池发酵中存在Empedobacter、Chryseobacterium和鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）等14 个正相关Hubs。

本文《酱香型白酒1轮次酿造细菌的菌群结构》来源于《食品科学》2020年41卷14期175-182页，作者：胡小霞，黄永光，涂华彬，胡峰，程平言，尤小龙。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190618-195。点击下 阅读原文 即可查看文章相关信息。

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