Br J Pharmacol (2区,IF=7.5)｜锁定Cul4B–NLRP3泛素化轴：MN-08促进NLRP3泛素化降解，缓解脓毒症急性肺损伤！(谷万杰-暨南大学)

2026年8月16日，暨南大学药学院、暨南大学附属第一医院重症医学科等团队，联合遵义医科大学珠海校区、广州Magpie Pharmaceuticals Co., Ltd.及岳阳市中心医院，在British Journal of Pharmacology （中科院2区，IF=7.5）在线发表题为“Cul4B up-regulation attenuates sepsis-induced acute lung injury by promoting NLRP3 ubiquitination and inhibiting NLRP3 inflammasome activation”的研究论文。Huihui Hu为第一作者，尹海燕、张在军和谷万杰为通讯作者。论文于2026年1月22日投稿，6月15日修回，6月20日接收。论文正式在线发表日期为2026年8月16日。

该研究聚焦Cullin 4B（Cul4B）与NLRP3炎症小体之间的调控关系。研究发现，脓毒症诱导急性肺损伤（ALI）时肺组织Cul4B明显下调；提高Cul4B表达能够改善肺组织损伤、炎症和肺泡屏障破坏，而髓系细胞特异性敲除Cul4B则产生相反效应。机制上，Cul4B能够与NLRP3相互作用并促进NLRP3泛素化，从而抑制NLRP3炎症小体激活。进一步研究发现，小分子MN-08可上调Cul4B，并通过Cul4B依赖的NLRP3泛素化和蛋白酶体降解发挥保护作用，为脓毒症ALI提供了一个新的“Cul4B–NLRP3泛素化”调控轴。

通讯作者简介

谷万杰（通讯作者）

● 医学博士

● 副主任医师

● 博士研究生导师

作为ICU医生，从事临床工作10余年，具备扎实的重症医学临床功底与丰富的麻醉学科背景，擅长各种疑难危重患者的救治。

本人长期聚焦脓毒症及相关器官功能损伤与保护的临床和基础研究，相关科研成果发表于JAMA、Intensive Care Medicine、Critical Care、Anesthesiology、British Journal of Anaesthesia、Journal of Nanobiotechnology等高影响力期刊。3项代表性成果获国际脓毒症权威指南《Surviving Sepsis Campaign: International Guidelines for Management of Sepsis and Septic Shock》引用，多项学术成果被纳入国内外临床实践指南。H指数为29，且连续4年（2022-2025）入选全球前2%顶尖科学家“年度科学影响力排行榜”，2025年入选“终身科学影响力排行榜”。作为项目负责人，主持国家自然科学基金面上项目1项，同时承担多项省、市级科研课题。

《Journal of Critical Care》统计学编辑

《European Journal of Anaesthesiology》助理编辑

《Journal of Intensive Medicine》青年编辑

H指数29。长期从事脓毒症、重症循环与呼吸支持、器官功能保护及围术期重症等领域研究，相关研究成果被国内外多项临床指南引用或采纳，包括SSC脓毒症指南等。

近三年代表性成果如下：

1. Duan XJ, Wang B, Li CL, Chen W, Ding P, Zhu JL, Wang JW, Hou XT, Yin HY, Gu WJ（通讯作者）. Heterogeneity of Treatment Effect for Intra-Aortic Balloon Pump Use Across Lactate Trajectories in Cardiogenic Shock Patients Supported by VA-ECMO: An Analysis of the Chinese Extracorporeal Life Support Registry.MedComm. 2026;7(4):e70698. IF: 14.1 Q1 B1. IF=14.1，Q1

2. Gu WJ（第一作者）, Huang W, Zhao FZ, Yuan XK, Jin K, Chen JL, Zhang CY, Huang Y, He L, Zhuang H, Yin HY, Chen T. Selenium nanoparticles as adjunctive therapy in sepsis: A pilot randomized clinical trial.Drug Resistance Updates.2026;86:101389. IF: 22.0 Q1 B1. IF=22.0，Q1

3. Guideline Working Group of the Chinese Society of Critical Care Medicine; Kang Y, Guan X, Chen D. Guidelines for the construction and management of critical care medicine in China (2025 Edition).Journal of Intensive Medicine. 2026;6(1):1–15. IF: 5.6 Q1 NA. IF=5.6，Q1

4. Gu WJ（第一作者）, Chen JL, Duan XJ, Zhang CY, Huang Y, Zhu MG, Yin HY. Magnesium Sulfate Alleviates Sepsis-Associated Acute Kidney Injury by Reducing Inflammation, Oxidative Stress, and Apoptosis via Inhibiting the NF-κB Pathway.FASEB Journal. 2026;40(2):e71456. IF: 4.3 Q1 B2. IF=4.3，Q1

5. Gu WJ（第一作者）, Cen Y, Zhao FZ, Wang HJ, Yin HY, Zheng XF. Association between driving pressure-guided ventilation and postoperative pulmonary complications in surgical patients: a meta-analysis with trial sequential analysis.British Journal of Anaesthesia.2024;133(3):647–657. IF: 10.3 Q1.

信息来源：https://faculty.jnu.edu.cn/lcyxy/gwj/list.htm

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【摘 要】

背景与目的：Cullin 4B（Cul4B）是CUL4B-RING E3泛素连接酶复合物的支架蛋白，主要发挥炎症负调控作用。本研究旨在探讨Cul4B在急性肺损伤（acute lung injury，ALI）中的作用及其对NLRP3泛素化的调控机制。

实验方法：研究首先在两种脓毒症诱导的ALI小鼠模型中检测Cul4B的表达及组织分布。随后分别采用肺组织特异性过表达Cul4B和髓系细胞特异性敲除Cul4B的方法，评价其对肺组织病理改变、肺部炎症及肺泡-毛细血管屏障功能障碍的影响。在THP-1细胞及Cul4B缺失的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中进一步评价Cul4B对NLRP3炎症小体激活的作用，并检测Cul4B与NLRP3之间的相互作用以及Cul4B介导的NLRP3泛素化。此外，研究还考察了Cul4B在小分子MN-08改善ALI及抑制炎症小体过程中的作用。

主要结果：脓毒症诱导ALI小鼠的肺组织中Cul4B表达显著下降。肺组织过表达Cul4B能够减轻肺损伤和炎症，而髓系细胞特异性敲除Cul4B则加重肺上皮屏障损伤及炎症反应，同时增强Nigericin诱导的NLRP3炎症小体激活。研究证实，Cul4B能够与内源性和外源性NLRP3发生相互作用，并通过促进NLRP3泛素化抑制NLRP3炎症小体激活。此前已被报道能够改善脂多糖（LPS）诱导ALI的小分子MN-08，在本研究中被发现可上调Cul4B表达，并通过促进NLRP3泛素化抑制NLRP3炎症小体激活。

结论与意义：上调Cul4B能够促进NLRP3泛素化，进而抑制炎症小体激活，减轻ALI中的肺上皮屏障功能障碍和炎症反应。研究提示Cul4B可能成为ALI的潜在干预靶点，同时为解释MN-08改善脓毒症诱导ALI的作用机制提供了新的实验依据。

01

研究背景及科学问题

急性肺损伤（ALI）是脓毒症最严重的并发症之一，其主要特征包括肺泡-毛细血管屏障破坏、血管通透性增加以及持续性低氧血症，严重时可进一步发展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。既往研究显示，约25%–50%的脓毒症患者可发生ALI，而ALI/ARDS死亡率最高可达到40%。

脓毒症ALI患者由于强烈炎症反应及肺组织结构破坏，气体交换能力明显下降，继而发生肺水肿和呼吸衰竭。目前ALI/ARDS仍缺乏有效的靶向药物，因此，脓毒症相关呼吸衰竭的治疗依然面临较大挑战。

细胞焦亡（pyroptosis）是一种程序性裂解性细胞死亡形式，可通过释放炎症介质和细胞内成分诱发炎症反应并参与疾病发生发展。炎症小体则是识别病原体入侵和组织损伤的重要信号平台，在多种炎症性疾病的启动及进展中发挥核心作用。

在炎症小体组装过程中，含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）响应NLRP3等受体信号后发生寡聚化，并进一步募集和激活caspase-1。活化的caspase-1能够切割gasdermin D（GSDMD），使其在细胞膜形成孔道并诱导细胞死亡，同时将白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-18前体加工为成熟细胞因子并释放至胞外。

大量证据表明，NLRP3炎症小体通过介导细胞焦亡和炎症级联反应，在ALI/ARDS发病过程中具有关键作用。NLRP3炎症小体过度激活可造成肺泡上皮细胞损伤、增加肺微血管内皮通透性、促进肺泡巨噬细胞过度活化，并影响中性粒细胞功能。因此，靶向抑制炎症小体及其介导的焦亡通路被认为是ALI/ARDS的重要潜在干预方向。

越来越多研究发现，NLRP3炎症小体组分受到多种翻译后修饰（posttranslational modifications，PTMs）的调节，包括泛素化、磷酸化和乙酰化。其中，NLRP3泛素化是控制炎症小体激活的重要机制。

E3泛素连接酶能够介导NLRP3发生不同类型的泛素化修饰，从而精细调控其活化。E3泛素连接酶主要分为RING、HECT和RING-between-RING（RBR）三大类。

Cullin 4B-RING E3泛素连接酶（CRL4B）复合物由Cullin 4B（Cul4B）、RING指蛋白ROC、衔接蛋白DDB1以及底物识别亚基DCAF等组成，主要参与表观遗传调节以及靶蛋白的泛素化降解。已有研究发现，巨噬细胞缺失Cul4B后，在Toll样受体（TLR）激活条件下促炎细胞因子生成增加，而抗炎细胞因子IL-10表达下降；髓系细胞特异性Cul4b敲除小鼠在LPS刺激或鼠伤寒沙门菌感染后的生存率也更低。

然而，Cul4B在ALI发生发展过程中的作用，以及其是否参与NLRP3炎症小体调控，仍缺乏明确认识。

研究团队此前发现，MN-08兼具N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA receptor）拮抗和一氧化氮（NO）释放作用，并能够抑制NLRP3炎症小体激活，从而改善LPS诱导的ALI。本研究进一步通过串联质量标签（TMT）蛋白质组学和Western blot发现，MN-08能够提高肺组织Cul4B蛋白表达，但Cul4B上调是否介导MN-08对脓毒症ALI的保护效应，以及其具体分子机制仍有待阐明。

因此，研究者提出假设：Cul4B可能通过促进NLRP3泛素化调节炎症小体激活，从而参与脓毒症诱导ALI的发生发展。本研究利用体内和体外模型，对Cul4B在脓毒症ALI中的作用及其调控机制进行了系统研究。

02

重要发现及亮点

脓毒症诱导的急性肺损伤中Cul4B表达下调

研究首先通过免疫荧光明确Cul4B在正常C57BL/6J小鼠肺组织中的细胞分布。结果显示，Cul4B可与巨噬细胞标志物F4/80、肺泡Ⅰ型上皮细胞（AT1）标志物AQP4以及内皮细胞标志物CD31共定位，但未与肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT2）标志物proSP-C明显共定位。

正常小鼠肺组织中的巨噬细胞数量较少，而脓毒症诱导后巨噬细胞明显增加。进一步检测发现，与正常小鼠相比，盲肠结扎穿孔（caecal ligation and puncture，CLP）诱导脓毒症小鼠肺组织中的Cul4B表达下降21.55%。

随后，研究分别采用腹腔注射LPS和CLP建立两种脓毒症ALI模型，并在造模后0、6、12、24、48和72 h收集血清及肺组织。结果显示，造模后6–24 h血清IL-6显著升高，而同期肺组织Cul4B蛋白水平明显下降，提示Cul4B可能参与脓毒症ALI的发生发展。

图1：脓毒症诱导的急性肺损伤（ALI）中Cul4B呈低表达。（a、b）正常C57BL/6J小鼠及盲肠结扎穿孔（CLP）诱导脓毒症小鼠肺组织切片中，Cul4B与F4/80、AQP4、CD31和proSP-C共定位的代表性免疫荧光图像。比例尺：20 μm（n=5）。（c）采用ImageJ分析Cul4B相对荧光强度（n=5）。（d）CLP术后不同时间点（0、6、12、24、48、72 h）血清IL-6水平（n=5）。（e–h）分别在腹腔注射脂多糖（LPS）后或CLP术后0、6、12、24、48和72 h收集小鼠肺组织；LPS模型n=8，CLP模型n=5。（e、g）为Cul4B蛋白代表性Western blot结果，（f、h）为Cul4B蛋白水平定量分析。数据以均值±SEM表示，**P<0.01，***P<0.001。

肺组织过表达Cul4B减轻脓毒症ALI及炎症反应

为了进一步明确Cul4B的作用，研究通过无创气管内滴注AAV2/6病毒载体，使Cul4B在小鼠肺组织中过表达。免疫荧光和Western blot均证实Cul4B过表达成功。

与Null-CLP组相比，Cul4B过表达后，CLP小鼠肺组织病理损伤明显改善，表现为支气管及肺泡结构恢复、肺泡间隔厚度下降以及炎症细胞浸润减少，肺损伤评分也相应下降。

同时，CLP明显升高肺组织湿/干重比（W/D）和支气管肺泡灌洗液（BALF）总蛋白浓度，提示肺水肿及血管通透性增加；Cul4B过表达能够显著逆转上述变化。

进一步检测发现，Cul4B过表达可阻止CLP诱导的紧密连接蛋白ZO-1和Occludin下调，并降低血清和BALF中的IL-6、IL-1β及IL-18水平。上述结果表明，提高肺组织Cul4B表达能够同时减轻病理损伤、抑制炎症反应，并维持肺泡屏障完整性。

图2：Cul4B过表达减轻脓毒症诱导的急性肺损伤（ALI）及炎症反应。（a）通过注射AAV病毒载体在肺组织中过表达Cul4B的实验设计示意图。（b、c）采用免疫荧光和Western blot验证肺组织Cul4B过表达的代表性图像（n=6）。（d）石蜡包埋肺组织切片H&E染色代表性图像，比例尺：100 μm（n=6）。（e）各组肺损伤组织学评分（n=5）。（f、g）检测肺组织湿/干重比（W/D）和BALF总蛋白水平，以评价肺水肿和肺血管通透性改变（n=6）。（h）肺组织ZO-1和Occludin的Western blot分析。（i）ZO-1和Occludin相对表达量定量分析（n=6）。（j）肺组织ZO-1（红色）和Occludin（绿色）分布及共定位的代表性免疫荧光图像，细胞核采用DAPI染为蓝色，比例尺：20 μm（n=6）。（k）采用ImageJ分析ZO-1和Occludin相对荧光强度（n=6）。（l–n）ELISA检测血清及BALF中IL-6（l）、IL-1β（m）和IL-18（n）水平（n=6）。数据以均值±SEM表示。NS表示差异无统计学意义；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。CLP：盲肠结扎穿孔。

髓系细胞Cul4B缺失进一步加重脓毒症ALI

为从相反方向验证Cul4B的作用，研究构建髓系细胞特异性Cul4b条件性敲除小鼠（Cul4bMKO），以同窝Cul4bcon小鼠作为对照。

Western blot证实骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中Cul4B成功缺失。与Cul4bcon-CLP小鼠相比，Cul4bMKO-CLP小鼠肺组织损伤更加严重，包括肺泡腔及肺血管内炎症细胞明显增多、肺水肿及血管淤血加重、肺泡间隔异常增厚，并出现更加明显的透明膜形成及间质增宽。

这一表型还表现为肺损伤评分、BALF蛋白浓度及肺组织W/D比进一步升高。与此同时，Cul4bMKO小鼠肺组织ZO-1和Occludin明显下降，血清和BALF中的IL-6、IL-1β及IL-18进一步升高。

因此，与Cul4B过表达实验形成相互印证的是，髓系细胞Cul4B缺失会明显加重脓毒症相关肺损伤和炎症反应。

图3：髓系细胞Cul4B缺失加重脓毒症诱导的急性肺损伤（ALI）及炎症反应。（a）采用Western blot验证巨噬细胞中Cul4b缺失的代表性结果（n=6）。（b）石蜡包埋肺组织切片H&E染色代表性图像，比例尺：100 μm（n=6）。（c）各组肺损伤组织学评分（n=6）。（d）肺组织W/D比和（e）BALF总蛋白水平，分别用于评价肺水肿及肺血管通透性改变（n=6）。（f）肺组织ZO-1、Occludin及Cul4B的Western blot分析。（g）ZO-1（n=6）、Occludin（n=6）和Cul4B（n=5）相对表达量定量分析。（h）肺组织ZO-1（红色）和Occludin（绿色）分布及共定位的代表性免疫荧光图像，细胞核采用DAPI染为蓝色，比例尺：20 μm（n=6）。（i）采用ImageJ分析ZO-1和Occludin相对荧光强度（n=6）。（j–l）ELISA检测血清和BALF中的IL-6（j）、IL-1β（k）和IL-18（l）（n=6）。数据以均值±SEM表示。NS表示差异无统计学意义；*P<0.05，***P<0.001。

Cul4B与NLRP3相互作用，并促进NLRP3泛素化以抑制炎症小体激活

前述结果提示Cul4B可能参与调节脓毒症ALI中的炎症级联反应。鉴于NLRP3炎症小体在这一过程中的核心作用，研究进一步探索Cul4B是否直接参与NLRP3炎症小体调控。

首先，在THP-1细胞中利用siRNA敲低Cul4B，并采用LPS+Nigericin刺激炎症小体。与siNC组相比，siCul4b组细胞上清中IL-1β和TNF-α分泌明显增加。

同样，在LPS+Nigericin刺激后，来源于Cul4bMKO小鼠的BMDMs中NLRP3和IL-1β表达高于Cul4bcon小鼠来源的BMDMs，提示Cul4B对NLRP3炎症小体具有抑制作用。作者同时指出，Cul4B缺失还影响TNF-α分泌和NLRP3炎症小体组分表达，提示其可能影响NLRP3炎症小体的priming阶段。

随后研究进一步探讨两者之间的分子联系。免疫共沉淀（IP）显示，在HEK293T细胞中过表达的Cul4B可以与NLRP3发生相互作用；在PMA诱导的THP-1巨噬细胞中，内源性Cul4B同样可以与内源性NLRP3相互作用。

HDOCK蛋白-蛋白分子对接提示，Cul4B可能与NLRP3的富含亮氨酸重复序列（LRR）结构域形成多个潜在结合位点。

进一步的泛素化实验显示，随着Cul4B表达增加，NLRP3泛素化水平呈剂量依赖性升高。由此说明，Cul4B可通过促进NLRP3泛素化而抑制炎症小体激活。

图4：Cul4B与NLRP3相互作用，并通过促进NLRP3泛素化抑制NLRP3炎症小体激活。（a）THP-1细胞转染阴性对照siRNA或Cul4B siRNA，采用Western blot检测THP-1细胞中Cul4B敲低效率（n=3）。（b、c）转染后的THP-1细胞接受LPS和Nigericin刺激，采用ELISA检测细胞上清中IL-1β（b）和TNF-α（c）释放水平（n=3）。（d）来源于Cul4bcon及Cul4bMKO小鼠的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）先以100 ng/mL LPS预处理4 h，再以Nigericin（10 μM）刺激30 min，Western blot检测细胞裂解物中NLRP3、CASP1、IL-1β及ASC。（e）NLRP3和IL-1β相对表达量定量（n=3）。（f）HEK293T细胞转染Myc标签Cul4B及Flag标签NLRP3 48 h后，采用抗Myc或抗Flag抗体进行免疫沉淀，并利用相应抗体进行免疫印迹分析（n=3）。（g、h）THP-1巨噬细胞裂解液分别采用兔IgG、抗Cul4B或抗NLRP3抗体进行免疫沉淀，并以图示抗体进行免疫印迹（n=3）。（i）NLRP3（蓝色）与Cul4B（绿色）相互作用的蛋白-蛋白分子对接分析。（j）HEK293T细胞共同转染Flag标签NLRP3、HA标签Ub及不同剂量Myc标签Cul4B；采用抗Flag抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀，再以相应抗体进行免疫印迹。由于上述实验n=3，因此作者未进行统计学分析，相关结果应视为初步证据。

MN-08减轻CLP诱导的急性肺损伤，并将Cul4B确定为潜在作用靶点

研究团队此前已经发现MN-08能够改善LPS诱导的ALI，本研究进一步在CLP诱导的脓毒症ALI模型中评价其作用。

CLP小鼠肺组织出现明显病理改变，包括细支气管-肺泡结构破坏、肺泡间隔增宽及炎症细胞聚集。MN-08或地塞米松处理均明显减轻上述改变。

MN-08预处理还降低BALF和血清中的IL-6水平，调节外周血中性粒细胞和淋巴细胞比例，并降低肺组织髓过氧化物酶（MPO）表达。与此同时，MN-08恢复了ZO-1和Occludin表达，提示其能够减轻炎症并维持肺上皮和内皮屏障完整性。

图5：MN-08减轻盲肠结扎穿孔（CLP）诱导的急性肺损伤（ALI）。（a）体内实验设计及给药方案示意图。（b）石蜡包埋肺组织切片H&E染色代表性图像，比例尺：100 μm（n=6）。（c）ELISA检测BALF和血清中的IL-6水平（n=6）。（d）采用血液分析仪检测小鼠全血中中性粒细胞和淋巴细胞比例；除Dex组n=4外，其余各组n=6。（e）肺组织MPO代表性免疫组织化学图像。（f）MPO相对表达量定量分析（n=4）。由于该实验n=4，作者未进行统计学分析，相关结果应视为初步证据。（g）Western blot检测肺组织ZO-1和Occludin。（h）ZO-1和Occludin相对表达量定量（n=6）。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

为了进一步寻找MN-08减轻脓毒症肺损伤的作用靶点，研究采用TMT定量蛋白质组学分析脓毒症小鼠肺组织。

LC-MS/MS共鉴定出4092个高可信度蛋白。在模型组与Sham组比较中，共获得560个差异表达蛋白；MN-08组与模型组相比则有96个差异蛋白。进一步通过Venn图和热图筛选出23个共同差异表达蛋白。

其中，Cul4B是排名最靠前的候选蛋白之一：其在模型组中下降，而MN-08干预后重新升高。Western blot在LPS和CLP两种脓毒症ALI模型中均验证了这一变化。

为了判断MN-08是否能够直接与Cul4B结合，研究进一步开展分子对接。结果显示MN-08对Cul4B具有较强结合亲和力，主要与Cul4B上的CYS230和ASN519形成氢键，对接评分为−6.06 kcal/mol。

细胞热转移实验（CETSA）进一步显示，在45–75 ℃范围内，30 μM MN-08处理可使Cul4B表观熔解曲线向右移动，即在相同温度下保留更多可溶性Cul4B蛋白，提示MN-08与Cul4B之间存在直接相互作用。

图6：Cul4B是MN-08干预脓毒症急性肺损伤（ALI）的潜在靶点。（a）Venn图和（b）热图显示23个共同差异表达蛋白。（c、d）Western blot检测LPS诱导（c）或CLP诱导（d）的脓毒症ALI小鼠肺组织中Cul4B表达。（e、f）Cul4B相对表达量定量分析，其中LPS诱导脓毒症ALI组n=8，CLP诱导脓毒症ALI组n=7。（g）分子对接分析MN-08与Cul4B之间的相互作用。（h、i）CETSA检测短时间药物孵育（1 h）后，在45–75 ℃不同温度下MN-08与Cul4B相互作用所引起的Cul4B热稳定性变化（n=3）。对于n=3的实验，作者未进行统计学分析，结果应视为初步证据。数据以均值±SEM表示。**P<0.01，***P<0.001。Ctrl：对照。

髓系细胞Cul4B缺失阻断MN-08对脓毒症ALI的保护作用

为了验证Cul4B是否真正介导MN-08的体内保护作用，研究采用髓系细胞特异性Cul4B缺失小鼠进行功能验证。

在Cul4bcon小鼠中，MN-08明显改善CLP引起的肺组织结构破坏、渗出性炎症及肺水肿；但在Cul4bMKO小鼠中，这种保护效应明显消失。肺组织仍表现为肺泡壁明显增厚且不规则、肺泡间质显著增宽，以及肺泡腔和肺血管中大量炎症细胞浸润。

同样，在Cul4bcon小鼠中，MN-08能够降低BALF中的IL-6、IL-1β和IL-18，并恢复ZO-1和Occludin表达；髓系Cul4B缺失后，这些作用均明显受到抑制。血清IL-6、IL-1β和IL-18的降低作用也出现同样变化。

研究随后采用腹腔注射LPS建立脓毒症休克模型并观察72 h生存情况。在Cul4bcon-LPS小鼠中，生存率仅为20%，MN-08可将生存率提高至60%。相比之下，Cul4bMKO小鼠在LPS注射后48 h内全部死亡，而MN-08未能逆转这一结局。

上述结果表明，髓系细胞Cul4B对于MN-08改善脓毒症ALI具有重要作用；当Cul4B缺失后，MN-08的保护作用明显丧失。

图7：髓系细胞Cul4B缺失阻断MN-08对脓毒症诱导急性肺损伤（ALI）的保护作用。（a）体内实验设计示意图。（b）石蜡包埋肺组织切片H&E染色代表性图像，比例尺：100 μm（n=6）。（c–e）ELISA检测BALF中IL-6（c）、IL-1β（d）和IL-18（e）水平（n=6）。（f）Western blot检测肺组织ZO-1、Occludin及Cul4B。（g）ZO-1、Occludin和Cul4B相对表达量定量（n=5–6）。（h）肺组织Cul4B（红色）和Occludin（绿色）分布及共定位的代表性免疫荧光图像；细胞核采用DAPI染为蓝色，比例尺：20 μm（n=6）。（i）采用ImageJ分析Cul4B和Occludin相对荧光强度（n=6）。（j–l）ELISA检测血清中IL-6（j）、IL-1β（k）和IL-18（l）；除CLP组n=6外，Sham组和MN-08组n=5。（m）腹腔注射脂多糖（LPS）建立脓毒症休克模型的实验示意图。（n）记录72 h生存情况（n=10）。数据以均值±SEM表示。NS表示差异无统计学意义；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。CLP：盲肠结扎穿孔。

Cul4B缺失阻断MN-08对NLRP3炎症小体的抑制作用

此前研究已发现MN-08能够抑制THP-1巨噬细胞以及LPS脓毒症模型中的NLRP3炎症小体激活。在本研究的CLP模型中，MN-08同样降低了肺组织NLRP3和IL-1β表达。

随后，研究从Cul4bcon和Cul4bMKO小鼠中分离BMDMs，以LPS+Nigericin诱导NLRP3炎症小体激活。MN-08能够明显降低NLRP3和IL-1β表达，但髓系细胞特异性敲除Cul4B后，这种抑制作用显著减弱。

在THP-1细胞中通过siRNA敲低Cul4B也得到相同结果：MN-08降低IL-1β和TNF-α的能力受到明显阻断。因此，MN-08抑制NLRP3炎症小体激活在很大程度上依赖Cul4B。

研究进一步利用免疫共沉淀检测NLRP3泛素化。与Sham组相比，CLP模型小鼠中NLRP3泛素化水平明显降低；MN-08处理后，NLRP3泛素化明显恢复，同时NLRP3蛋白水平下降。

为了进一步验证其是否通过蛋白酶体降解途径发挥作用，研究加入蛋白酶体抑制剂MG132。结果显示，MG132明显阻断了MN-08降低THP-1巨噬细胞中NLRP3蛋白表达的作用。

综合来看，MN-08通过上调Cul4B促进NLRP3泛素化，并进一步促进其经泛素-蛋白酶体途径降解，从而抑制NLRP3炎症小体激活。

图8：MN-08通过Cul4B抑制NLRP3炎症小体激活，并促进NLRP3泛素化降解。（a）Western blot检测肺组织中NLRP3、CASP1、IL-1β和ASC表达（n=6）。（b）来源于Cul4bcon和Cul4bMKO小鼠的BMDMs先以100 ng/mL LPS预处理4 h，再以MN-08（30 μM）处理2 h，随后加入Nigericin（10 μM）刺激30 min；Western blot检测细胞裂解物中NLRP3、CASP1、IL-1β和ASC。（c、d）THP-1细胞转染阴性对照siRNA或Cul4B siRNA后接受LPS和Nigericin刺激，采用ELISA检测细胞上清中IL-1β（c）和TNF-α（d）的释放（n=3）。（e）CLP模型小鼠中NLRP3与泛素的免疫共沉淀分析（n=3）。（f、g）泛素及NLRP3相对表达量定量（n=3）。（h）加入MG132（10 μM）后采用Western blot检测NLRP3蛋白表达。（i）NLRP3相对表达量定量（n=3）。对于n=3的实验，作者未进行统计学分析，相关结果应视为初步证据。数据以均值±SEM表示。NS表示差异无统计学意义；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

【贡献】★★★★★

本研究表明，Cul4B是抑制NLRP3炎症小体激活的关键调控因子。提高Cul4B表达能够促进NLRP3泛素化及其后续降解，从而减轻脓毒症诱导急性肺损伤中的肺上皮屏障功能障碍和炎症反应。

这些结果提示，Cul4B可能成为脓毒症诱导ALI的潜在干预靶点。此外，本研究进一步提示，小分子MN-08可通过靶向Cul4B发挥作用，因此具有作为脓毒症ALI候选干预分子进一步研究的潜力。

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