《食品科学》：贵州大学母应春正高级实验师等：洞酿酱香酒第2轮次堆积发酵中酒醅微生物群落与挥发性风味物质关联分析

酱香型白酒简称酱酒，以其独特的酱香风味、丰满的酒体以及优雅细腻的香气且回味悠长等特点而享誉盛名。其风味构成是原料、环境、生产工艺及贮藏等因素共同作用的结果。传统酱酒酿造依赖开放式环境，在生产过程中的微生物群落易受季节性温湿度波动影响，导致最终产品的批次间品质产生差异。与之相比，洞酿酱香酒依托于天然溶洞生态系统进行酿造。洞内形成恒温恒湿（常年保持18～22 ℃）的稳定封闭环境为酿造微生物的富集与代谢提供了稳定条件。此外，当地气候湿润、四季分明，洞体本身具有上、中、下三洞联通、通风良好的结构特点，加之洞内深厚的沉积土壤为建造窖池提供了天然条件。在此独特的微生态环境基础上，结合高温大曲等传统工艺，最终形成了独特的“洞酿酱香”体系，成就了其酒体醇厚优雅、回味细腻悠长的风味特征。目前研究主要聚焦于洞酿酱香酒微生态环境，但对于核心工艺环节特别是第2轮次堆积发酵中微生物与风味的动态关联机制尚缺乏系统解析。

堆积发酵是酱酒酿造过程中微生物扩增富集的关键阶段，直接决定了基酒产出效率与风味品质。该阶段通过酒醅与外界环境的充分接触，可捕获并富集多样化的糖化、发酵及产香微生物，为后续窖池发酵提供菌种资源；同时，其代谢产物与酶系的积累可为酱香风味的形成奠定基础。酱香型白酒的酿造周期通常为7个轮次，其中第2轮次处于发酵中期阶段，具有淀粉转化率高、风味物质大量形成和积累的优势，其工艺周期约96 h，通过高温堆积使温度逐步升至40～45 ℃。针对第2轮次堆积发酵，张春林等系统探讨了酒醅的理化特性与微生物组成，揭示了环境因子对群落结构的驱动作用；黄蕴利等利用高通量测序（HTS）技术在酒醅中鉴定出138 个属细菌和54 个属真菌，并明确了淀粉、总酸含量等关键理化指标与裸胞壳属（Emericella）、曲霉属（Aspergillus）等微生物的显著相关性（P＜0.01）。张红霞进一步指出，此阶段酵母菌群的多样性及分布是维持乙醇产率和菌群稳态的关键因素。此外，李喆等通过空间位置差异分析，明确了二轮次堆积发酵中关键代谢产物的动态变化规律。鉴于第2轮次堆积发酵在核心微生物富集与关键风味前体物质形成中的关键作用，贵州大学酿酒与食品工程学院的罗华艳、母应春*和苏伟等人聚焦于洞酿环境下的第2轮次堆积发酵阶段，结合HTS与固相微萃取-气相色谱-质谱（SPME-GC-MS）联用技术，系统剖析此过程中酒醅微生物群落结构与挥发性风味的演替规律及二者间的关联性，旨在为洞酿酱香酒工艺的稳定化与规模化应用提供坚实的依据，并为定向优化发酵参数、提升白酒的品质奠定理论基础。

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白酒发酵过程中酒醅理化性质的变化

表1显示了白酒发酵过程中酒醅理化指标的动态变化。随着发酵进行，微生物的快速生长与富集驱动了酒醅状态的显著改变。酒醅的温度与水分质量分数在发酵前期（0～72 h）维持稳定后，因微生物代谢产热及释放结合水，于堆积发酵96 h后分别显著上升至44.33 ℃和54.94%。在本研究所述的洞穴入口环境中，酒醅达到入窖温度所需时间与传统环境一致。在整个发酵过程中，淀粉质量分数持续下降，从0 h的32.24%显著下降到96 h的25.82%，表明淀粉在微生物糖化酶的作用下不断被分解和消耗，逐步转化为可利用的碳源。与此同时，还原糖与酸度则呈现显著上升趋势，这一变化规律与传统环境下的相关研究结果一致。酒醅中还原糖含量的增加主要来自于淀粉的逐步水解，至堆积发酵96 h时，随着微生物生长趋于平缓，还原糖得以持续累积。酸度于堆积发酵96 h时达到峰值4.99 mL/g（0 h为3.55 mL/g），这可能归因于发酵过程中多种微生物代谢活动所产酸的积累。例如，霉菌分泌的酸性蛋白酶可有效降解醅堆中的蛋白质，生成氨基酸等酸性物质。上述结果表明，酒醅中各项理化因子的动态变化与微生物群落的演替密切相关，共同构成了白酒发酵微生态中复杂的互作关系。

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微生物的丰富性和多样性

利用Illumina MiSeq基因测序仪检测酒醅在第2轮次堆积发酵过程中的微生物群落变化。细菌和真菌的有效序列数分别在37 683.67～43 937.67和11 973.00～55 373.33之间（表2）。如图2所示，稀释曲线随着测序深度的增加而逐渐趋于平缓，表明测序数据量合理，结果可充分反映洞酿酱香酒第2轮次堆积发酵酒醅样本中细菌与真菌的群落多样性特征。

在评价指标方面，Chao1指数常用于反映物种丰富度，Shannon指数和Simpson指数多用于评估群落的物种多样性。细菌群落在初始阶段（SE0 h）的Chao1指数高达294.50，显著高于后期发酵阶段，同时Shannon指数（5.30）和Simpson指数（0.94）也处于峰值，反映了初始状态中原料、酒曲及环境中微生物组成的复杂性；而真菌群落的Chao1指数在48 h时达到峰值（98.00），Shannon指数（2.93）和Simpson指数（0.69）在24 h时骤升，随后趋于平稳，表明真菌群落在发酵进程中呈现出先增加后稳定的演变特征。随着发酵进程的推进，细菌群落的丰富度与多样性在后期（SE72 h）降至最低，即Chao1指数为188.69，Shannon指数为4.41及Simpson指数为0.88，说明堆积发酵后期的高温（44.33 ℃）和高酸环境（4.99 mL/g）对部分细菌的生长有抑制作用；尽管真菌的Chao1指数在96 h时下降至64.00，但Shannon指数仍维持在较高水平（3.34），反映出其多样性未出现剧烈衰减。综合分析可知，在第2轮次洞酿酱香酒的堆积发酵过程中，细菌群落的丰富度与多样性先降后回升，而真菌丰富度先升后下降，其多样性整体趋于增加；且整个过程中酒醅细菌的丰富度及多样性始终高于真菌。

图3展示了酒醅中真菌与细菌群落结构的主坐标分析（PCoA）结果，揭示了发酵过程中微生物β多样性的动态变化。真菌群落分析中，PCo1和PCo2分别解释了46.73%和11.88%的变异度（图3a）。发酵初期（SE0 h）样本集中于坐标系左下方区域，而发酵末期（96 h）样本则明显分布于右上方，表明真菌群落结构在发酵初期与后期存在显著差异。发酵中期（24～72 h）样本在二维空间中呈现渐进式迁移态势，其中SE72 h与SE96 h样本空间位置较为接近，表明两者真菌群落结构具有较高的相似性。细菌群落呈现相似演变规律，PCo1和PCo2的累计方差贡献率达61.38%（图3b）。SE0 h与SE96 h样本在空间中呈现明显分离，中间阶段样本随发酵时间的延长逐步过渡。这种微生物群落结构的动态变化与发酵过程中环境参数的改变密切相关，如温度从29.67 ℃升至44.33 ℃、水分质量分数从45.12%增至54.94%，这些因素共同驱动了细菌与真菌群落的系统性演替。

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微生物群落结构

根据高通量测序结果，本研究将平均相对丰度大于1.00%的细菌门与属界定为优势菌群，低于此阈值的类群则统一归为其他。未能在门或属水平完成分类学鉴定的序列，标记为未分类。

在细菌群落方面，共检测出22 个细菌门（图4a）。其中，厚壁菌门（Firmicutes）以92.61%的平均相对丰度占据绝对优势。该菌群所具有的耐高温特性，与发酵进入后期时体系温度升高至44.33 ℃的条件形成显著的协同适应关系。这一优势分布，与已有相关研究报道的茅台地区及常规酒厂在第2轮次发酵中厚壁菌门的主导规律一致。同时，由于洞酿环境中酒醅的持续高温（＞40 ℃）显著抑制了需氧微生物的生长繁殖，放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度随发酵进行明显下降，这一变化趋势与传统发酵体系中放线菌门在中、后期表现出更高活性的结果形成了鲜明对比。在真菌群落层面，共鉴定出8 个真菌门（图4b）。子囊菌门（Ascomycota）以95.49%的平均相对丰度占据绝对优势。其群落优势得益于该门类真菌对多种极端环境因子的综合耐受能力，如持续高温及高酸等。

在属水平上，酒醅样品共检测到364 个细菌属，其中枝芽孢菌属（Virgibacillus，25.64%）、海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus，19.04%）、克罗彭斯特德菌属（Kroppenstedtia，14.57%）、芽孢杆菌属（Bacillus，13.60%）、高温放线菌属（Thermoactinomyces，7.86%）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora，2.32%）、乳杆菌属（Lactobacillus，1.85%）、假纤细芽孢杆菌属（Pseudogracilibacillus，1.35%）和魏斯氏菌属（Weissella，1.09%）这9 个优势属累计相对丰度达到87.32%（图5a）。堆积发酵初期（SE0 h），枝芽孢菌属（21.47%）、海洋芽孢杆菌属（17.74%）、克罗彭斯特德菌属（14.97%）和芽孢杆菌属（13.18%）为优势菌，此群落结构与传统酱香型白酒酿造过程的细菌组成特征相似。枝芽孢菌属的耐高温特性与高蛋白酶活性可促进发酵糖及氨基酸积累，与酒体风味物质含量呈显著正相关。芽孢杆菌属通过分泌糖化酶、淀粉酶和蛋白酶等催化原料水解，其产生的抗菌脂肽还调控微生物群落组成。随着发酵进行，酒醅温度逐渐升高（96 h达44.33 ℃），除了前述4 个优势细菌属外，高温放线菌属因耐热性在发酵后期相对丰度从0 h的4.98%上升为11.03%，成为优势属之一，与发酵升温驱动的微生物演替规律一致。

酒醅样品中共鉴定出97 个真菌属，其中6 个优势真菌属分别为嗜热真菌属（Thermomyces，46.65%）、热子囊菌属（Thermoascus，13.91%）、复膜孢酵母属（Saccharomycopsis，10.12%）、曲霉属（Aspergillus，9.89%）、红曲霉属（Monascus，4.64%）和哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania，1.15%）（图5b）。嗜热真菌属在堆积发酵初期（SE0 h）的相对丰度为68.71%，随发酵的进行其相对丰度逐渐降低至96 h的32.14%，可能是因为堆积发酵过程中温度不断上升并超过其最适生长范围，导致生长繁殖受到抑制。复膜孢酵母属在整个发酵周期中占比保持稳定，该菌属能分泌多种酶分解淀粉，并在产品风味形成和香气复杂度构建中发挥关键作用。曲霉属在96 h时降至4.68%，其产生的α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶有助于淀粉水解和乙醇生成过程。值得注意的是，红曲霉属在96 h时的相对丰度显著提升至12.48%，该菌属分泌的酯酶可有效促进苯乙醇、肉豆蔻酸乙酯等风味物质生成。整体而言，洞酿环境中的温度梯度变化驱动了微生物群落的演替。具体表现为发酵初期以耐热芽孢杆菌、嗜热真菌为主导，随温度升高逐步转向高温放线菌与红曲霉等嗜热菌属；这一过程通过微生物酶系统如蛋白酶、淀粉酶等协同作用，持续催化原料水解与代谢，生成发酵糖、氨基酸衍生物及酯类等风味前体或风味物质，构成了洞酿酱香酒风味形成的微生态基础。

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微生物群落功能预测

基于检测到的微生物基因组序列，使用PICRUSt2软件预测洞酿酱香酒第2轮次堆积发酵酒醅中微生物代谢功能。对细菌菌群在京都基因与基因组百科全书（KEGG）-level-1及KEGG-level-2层级进行富集并分类，剔除人类疾病等无关代谢途径后，KEGG-level-1共注释到5 条核心代谢途径，KEGG-level-2共注释到47 条代谢途径。其中，相对丰度排名前10的功能见表3。在KEGG-level-1上，代谢始终占据主导地位，其相对丰度范围为73.03%～74.14%。这与米香型白酒发酵体系的研究结论一致，进一步印证了在酱香型白酒堆积发酵过程中，微生物驱动的基础代谢是核心生化进程，主要表现为对原料中的蛋白质、淀粉等大分子物质的分解，进而生成小分子风味前体物。此外，遗传信息处理（9.80%～10.17%）和细胞过程（6.18%～6.91%）的丰度在发酵过程中保持相对稳定，反映了酒醅微生物群落在适应高温（44.33 ℃）及高酸（4.99 mL/g）极端发酵环境下维持基本生命活动的需求。KEGG-level-2层面，氨基酸代谢（17.20%～17.34%）、碳水化合物代谢（14.89%～15.01%）、辅因子和维生素代谢（14.26%～14.78%）共同构成了酒醅微生物的核心代谢网络，与淀粉消耗（由32.24%降至25.82%）及还原糖积累（由2.69%升高至4.08%）的动态吻合，表明微生物在KEGG-level-2层面的优势代谢功能直接关联于其对碳源和氮源的基础利用与转化，为后续风味物质的形成提供了关键的前体物质。

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酒醅堆积发酵过程中挥发性风味物质的动态变化分析

在酒醅堆积发酵过程中共检测出44 种挥发性风味物质，包括酯类22 种、醇类6 种、醛类6 种、酚类4 种、酸类2 种和其他类4 种（图6a）。随着发酵的进行，醇类和酯类物质的整体含量呈现显著上升趋势；而醛、酚、酸等其他类物质的含量在0 h时最高，在发酵后期出现一定波动。在堆积发酵阶段，酯类物质的富集主要源于酵母菌与乳酸菌的协同代谢作用。较高堆积温度（40～45 ℃）有效促进了酯化酶活性，推动了乙醇与有机酸（如乙酸、己酸）发生酯化反应，生成乙酸乙酯、己酸乙酯等具有果香特征关键酯类物质。同时，淀粉降解产生的糖类为酯类物质的合成提供了充足的碳源，进一步促使酯类在发酵中期（48～72 h）出现显著富集（图6a）。主成分分析（PCA）结果显示，PC1与PC2共同解释了89.3%的原始信息，样品点随着发酵时间从第3象限向第4象限有序移动（图6b），表明挥发性风味物质的组成呈现连续且定向的演变；此外，SE72 h与SE96 h样品的显著分离进一步印证了堆积发酵后期（＞72 h）风味物质的组成发生了显著变化。

OPLS-DA结果显示，模型参数优异（R2X=0.978，R2Y=0.968，Q2=0.892)（图6c），揭示了组间差异的特异性。经200 次置换检验，Q2回归线截距为－0.912 （图6d），证实模型稳定可靠，未过度拟合，可用于解析酒醅发酵过程中的代谢变化。基于此模型，以变量投影重要性（VIP）＞1与P＜0.05为标准，共筛选出14 种具有显著组间差异的挥发性风味化合物（图7），包括酯类6 种、醛类3 种、醇类2 种、酚类1 种和其他物质2 种，揭示了其在发酵进程中的动态变化规律。酯类作为主导风味组分，其生成主要依赖微生物代谢与酯化反应，通常呈现果香味。具体而言，3-羟基丁酸丁酯、丁二酸二乙酯和9-十六碳烯酸乙酯含量随发酵推进持续上升至峰值；而苯乙酸丙酯与2-苯乙基丙酸酯仅在0、24、96 h 3 个时间点被检出。γ-壬内酯含量则呈现先升后降的趋势，其在48 h时达到峰值后因高温导致热不稳定性而发生降解，体现了发酵环境中温度因素对风味代谢的调控作用。本研究检测的挥发性风味物质以酯类为主，其气味阈值普遍较低，对白酒的整体香气有很大贡献。醛类化合物在发酵过程中总量逐步下降，其可还原转化为醇类，进一步参与酯类合成。其中，3-糠醛主要源于还原糖与氨基酸在升温阶段发生的美拉德反应，其生成与体系中还原糖积累同步。

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发酵过程中优势菌属与显著差异风味物质的相关性分析

本研究基于整个发酵阶段的数据（0～96 h）对15 个优势菌属与14 种显著差异风味物质（VIP＞1，P＜0.05）进行Pearson相关性分析，旨在系统揭示微生物群落对风味物质的调控机制（图8）。结果表明，微生物与风味物质之间共存在23 对显著关联（|r|＞0.7，P＜0.05），其中18 对呈显著正相关、5 对呈显著负相关。哈萨克斯坦酵母属与异戊醇（r＝0.996）、9-十六碳烯酸乙酯（r＝0.989）和3-羟基丁酸丁酯（r＝0.983）呈极显著正相关，表明该菌属是酯类与醇类风味化合物形成的主要贡献者。这与Zhang Xue等的研究结果高度一致，该研究证实了哈萨克斯坦酵母属与多种醇类、酯类物质的强正相关性。作为一种常见于发酵酒中的酵母，该菌属能在高酸、高温环境中维持高效的乙醇发酵活性；其代谢产物乙醇在高温条件下可进一步与脂肪酸发生酯化反应，从而推动风味物质的积累。乳杆菌属与壬醛（r＝0.983）、苯乙酸丙酯（r＝0.932）呈显著正相关，但与丙位壬内酯（r＝－0.955）呈负相关，这一结果揭示了其在代谢路径上的双向功能：该属能催化氨基酸与乙酰辅A形成醇醛类物质，还可以分泌羧酸酯酶促进脂肪酸与乙醇生成相应的酯类，同时还可能对丙位壬内酯的合成路径产生抑制作用，从而实现对风味物质的调控。红曲霉属与3-羟基丁酸丁酯（r＝0.901）及9-十六碳烯酸乙酯（r＝0.893）均呈显著正相关，其分泌的大量酯酶可催化脂肪酸与醇类发生反应，促进酯类物质的合成，与既往研究中红曲霉在发酵食品中强化酯香的作用一致。糖多孢菌属、假纤细芽孢杆菌属和嗜热真菌属均与邻苯二甲醚呈现显著负相关（r分别为－0.951、 －0.904、－0.933）。热子囊菌属与1,2-二甲氧基-4-乙基苯（r＝0.966）、2,4-二叔丁基苯酚（r＝0.951）呈显著正相关，其所分泌的多酚氧化酶催化酚类化合物的生成。这与任婷婷的研究中热子囊菌属与酚类物质呈显著正相关的结果一致，确认了该菌为酚类风味形成的核心驱动菌属。

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结论

本研究系统解析了洞酿酱香酒第2轮次堆积发酵过程中酒醅的理化特性、微生物群落结构以及挥发性风味物质的动态变化规律，并深入探讨优势微生物属与显著差异挥发性风味物质间的相关性。结果显示，在发酵过程中，酒醅的温度、水分含量、还原糖和酸度呈现逐步上升趋势，而淀粉含量则呈现递减趋势。高通量测序结果表明，厚壁菌门与子囊菌门分别占据细菌和真菌群落的绝对优势地位；在属水平上，枝芽孢菌属、海洋芽孢杆菌属、克罗彭斯特德菌属和芽孢杆菌属为优势细菌属，而嗜热真菌属、热子囊菌属、复膜孢酵母属、曲霉属、红曲霉属和哈萨克斯坦酵母属则为优势真菌属。微生物群落功能预测分析表明，在KEGG-level-1层面，代谢功能为酒醅堆积发酵过程中的核心功能，在KEGG-level-2层面，主要代谢途径包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、辅因子和维生素的代谢、其他氨基酸的代谢、脂质代谢等。本研究共检测出44 种挥发性风味化合物，其中14 种差异显著（VIP＞1，P＜0.05）。相关性分析表明，15 个优势菌属与14 个挥发性风味物质间存在18 对显著正相关关系（P＜0.05），5 对显著负相关关系（P＜0.05）。乳杆菌属与苯乙酸丙酯、丙酸-2-苯乙酯及壬醛呈显著正相关，红曲霉属和哈萨克斯坦酵母属分别与3-羟基丁酸丁酯、9-十六碳烯酸乙酯及异戊醇呈显著正相关。本研究可为洞酿酱香酒的品质特性提供数据支撑，并为后续酿造工艺的优化改进奠定理论基础。

引文格式：

罗华艳, 母应春, 苏伟, 等. 洞酿酱香酒第2轮次堆积发酵中酒醅微生物群落与挥发性风味物质关联分析[J]. 食品科学, 2026, 47(8): 164-173. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251015-087.

LUO Huayan, MU Yingchun, SU Wei, et al. Correlation analysis between microbial community and volatile flavor compounds in fermented grains during the second round of stacking fermentation of cave-brewed Jiangxiangxing Baijiu[J]. Food Science, 2026, 47(8): 164-173. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251015-087.

实习编辑：李帆；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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