FSHW | 药用植物源天然产物千金藤碱通过靶向TNF-α阻断NF-κB信号通路发挥抗类风湿关节炎作用

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Introduction

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是类风湿关节炎（RA）发病机制中的关键因子，被视为药物开发的潜在靶点。TNF-α与受体结合后激活核因子κB（NF-κB）信号通路对RA病程进展至关重要。千金藤碱（SA）是一种近期从千金藤属植物中分离出的异喹啉阿朴啡型生物碱，虽已知具有抗炎特性，但其作用机制尚未明确。云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室刘提提副教授、段美艳硕士、盛军教授、徐欢欢副教授等探讨了SA是否可通过抑制TNF-α相关的NF-κB信号通路改善RA。实验结果显示，SA与TNF-α的结合亲和力（KD）为2.934×10-6 mol/L。在10 μmol/L浓度下，SA能有效阻断TNF-α与其受体TNFR1/TNFR2的结合。体外实验中，SA不仅阻止了TNF-α诱导的L929细胞死亡，还在293-TNF-α反应细胞、HFLS及MH7A细胞系中抑制了TNF-α触发的NF-κB活化。在胶原诱导关节炎（CIA）小鼠模型中，SA通过抑制NF-κB信号通路显著缓解RA症状。本研究证实了天然化合物SA作为TNF-α抑制剂干预RA的潜在价值。

结果与讨论

SA抑制TNF-α诱导的L929细胞死亡及NF-κB活化

SA的化学结构见图1A。实验采用TNF-α敏感细胞系L929，通过MTT法证实SA（0.312 5~10 μmol/L）无细胞毒性（图1B）。SA可剂量依赖性（0.625~5 μmol/L）抑制TNF-α/ACT-D诱导的L929细胞凋亡（图1C），并改善细胞膜破裂等形态学损伤（图1D-E）。NF-κB报告基因检测显示，SA（0.625~10 μmol/L）能显著抑制TNF-α诱导的NF-κB活化（图1F），证实其通过阻断TNF-α信号通路发挥抗炎作用。

图1 SA抑制TNF-α诱导的L929细胞死亡及NF-κB活化

SA抑制TNF-α诱导的HFLS及MH7A细胞中NF-κB信号通路的活化

滑膜成纤维细胞（HFLS/MH7A）是RA关节破坏的关键效应细胞。MTT实验证实5 μmol/L SA无细胞毒性（图2A-B）。Western blot显示SA能显著抑制TNF-α诱导的IKKα/β、IκBα和p65磷酸化（HFLS细胞30 min，MH7A细胞60 min）（图2C-E），表明SA通过阻断NF-κB通路活化发挥干预作用。

图2 SA抑制TNF-α诱导的HFLS及MH7A细胞中NF-κB信号通路的活化

SA抑制TNF-α诱导的HFLS及MH7A细胞中p65核转位

免疫荧光及核蛋白提取实验证实，SA能显著抑制TNF-α诱导的HFLS和MH7A细胞中p65核转位（图3A-D），表明其可阻断NF-κB通路活化。

图3 SA抑制TNF-α诱导的HFLS及MH7A细胞中p65核转位

SA抑制TNF-α与TNFR的相互作用

表面等离子共振（SPR）分析显示，SA可直接结合TNF-α（KD=2.934×10-6 mol/L），但未与TNFR1/2结合（图4A-C）。竞争实验证实10 μmol/L SA能显著抑制TNF-α与TNFR1/2的相互作用（图4D-E），表明SA通过靶向TNF-α阻断其受体结合。

图4 SA抑制TNF-α与TNFR的相互作用

SA改善CIA小鼠的RA症状

从第23天起，隔日测定小鼠后爪厚度并评估关节肿胀、发红及变形程度进行RA评分。结果显示，CIA模型组小鼠后爪厚度及RA评分显著高于正常组，而SA和AD干预均能显著减轻肿胀及症状，且两者疗效相当（图5）。实验证实SA具有一定缓解RA的作用，提示其潜在干预价值。

图5 SA改善CIA小鼠的RA症状

SA对CIA小鼠关节病理结构的影响

关节软骨破坏是RA的典型骨损伤表现。通过H&E染色发现，CIA模型组小鼠膝关节、踝关节和趾关节均出现明显滑膜增生、炎性细胞浸润及关节腔狭窄，而SA和AD干预能显著改善这些病理特征。番红O/固绿和甲苯胺蓝染色显示，SA干预可有效减轻软骨组织破坏，促进关节表面软骨附着。结果表明SA能缓解RA及其引发的软骨损伤（图6）。

图6 SA对CIA小鼠关节病理结构的影响

SA对CIA小鼠关节破骨细胞形成及p-p65表达的影响

骨侵蚀是RA的重要病理特征，主要由破骨细胞成熟及NF-κB信号激活所致。TRAP染色显示，模型组小鼠关节中破骨细胞数量显著增加，SA和AD干预可有效减少TRAP阳性细胞（图7A）。Western blot结果表明，SA能显著下调破骨细胞相关标志蛋白（c-Src、c-Fos等）及p-p65表达（图7B,C）。免疫组化进一步证实SA可抑制关节组织中p-p65的过度活化（图7D-G）。研究表明SA通过调控NF-κB通路减轻RA骨破坏。

图7 SA对CIA小鼠关节破骨细胞形成及p-p65表达的影响

SA对CIA小鼠脾脏的影响

RA作为一种自身免疫性疾病，与免疫系统紊乱密切相关。研究发现，模型组小鼠脾脏指数显著升高，淋巴滤泡明显增生；SA和AD干预可降低脾脏指数，减少淋巴滤泡数量和体积（图8A-C）。免疫组化显示，SA能显著下调脾脏T细胞标志物CD3ε和CD4的表达（图8D）。结果表明，SA可通过抑制脾脏免疫细胞过度活化发挥抗RA作用。

图8 SA对CIA小鼠脾脏的影响

结论

SA与TNF-α具有高亲和力，其结合可阻断TNF-α与受体的相互作用，从而抑制NF-κB信号通路的级联激活。更重要的是，SA通过体内抑制NF-κB信号通路能有效缓解类风湿关节炎（RA）症状。因此，SA有望成为通过选择性靶向TNF-α干预RA的新型候选药物。

第一作者简介

刘提提，女，博士，副教授，云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室青年骨干成员，主要从事食药资源天然化合物的生物学效应及分子机制研究，尤其对以TNF家族RANKL、TNF-α等为靶点研究天然化合物的抗骨质疏松及抗类风湿性关节炎的作用和机制的理解较为深刻，主持云南省科技计划项目2 项，以第一/通信作者（含共同）身份发表SCI收录论文10 篇（其中Top期刊论文8 篇），IF>5分SCI收录论文9 篇。

段美艳，女，硕士，云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室2024届硕士研究生，研究方向为天然化合物抗类风湿性关节炎的作用和机制，主持云南省教育厅项目1 项，以第一作者（含共同）身份发表学术论文4 篇（其中Top期刊论文2 篇）。

通信作者简介

盛军，二级教授，日本大阪大学博士，原卫生部长春生物制品研究所所长、原云南农业大学校长、云南省高原特色农业产业研究院院长；现任中国微生物学会常务理事，云南省微生物学会理事长，教育部高等学校教学指导委员会委员。长期从事食药资源组学研究、功能机理解析和成果转化，在植物基食品组学、功能活性成分解析以及精准营养产品上取得系列成果。破译特色植物资源基因组，构建了国际上首个食药同源资源跨组学数据；创建跨界物种植物多酚生物合成大数据，揭示植物基食物多酚调节代谢免疫机制。建立了植物基功能组分定向发酵富集技术，创新集成工艺装备，建成普洱茶、辣木、核桃等深加工技术体系，研制系列新产品，并实现产业化推广应用，产生了显著的经济效益和社会效益。获授权专利73 件，发表论文309 篇（SCI论文160 篇），以第一或通信作者在Science、NatureCommunications、MolecularPlant等杂志上发表论文138 篇，出版学术著作4 部。获吉林省科技进步一等奖、云南省科技进步一等奖、云南省科技进步特等奖、云南省科学技术杰出贡献奖、世界茶业大会普洱茶特别贡献奖；入选云南省科技领军人才、首批国家跨世纪百千万人才工程国家级人选、全国优秀科技工作者。

徐欢欢，男，博士，副教授，硕士研究生导师，云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室副主任，云南省“兴滇英才支持计划”青年人才，华东师范大学访问学者，研究方向为食药同源天然产物生物活性及分子机制，研究疾病集中于类风湿性关节炎、骨质疏松、皮肤光老化、衰老、肿瘤等，作为负责人构建了天然化合物实体库（大于3 600 个），能熟练运用分子互作技术（SPR/BLI/ITC）进行相关药物筛选及开发，主持国家自然科学基金青年科学基金项目1 项、省部级项目5 项，现以第一/通信作者（含共同）身份发表SCI收录论文26 篇，授权实用新型专利4 件，申报发明专利4 件。

Stephanine interacts with TNF-α to block NF-κB signaling and protects against rheumatoid arthritis

Titi Liua,b,1, Meiyan Duana,1, Jin Lia,1, Wei Dongc, Yingqi Yina, Honglei Huid, Jing Xua, Zhe Jianga, Chunxia Gana, Zemin Xianga, Jun Shenga,*, Xuanjun Wanga,*, Huanhuan Xua,b,*

a Key Laboratory of Pu’er Tea Science, Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

b College of Science, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

c Department of Obstetrics and Gynecology, The First People’s Hospital of Yunnan Province, The Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology, Kunming 650032, China

d Department of Laboratory Medicine, Southern Central Hospital of Yunnan Province, The First People’s Hospital of Honghe State, Honghe 661100, China

1 These authors contributed equally to this study.

*Corresponding authors.

Abstract

Tumor necrosis factor-α (TNF-α) is a key player in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA) and considered a promising target for therapeutic drug development. Activation of the nuclear factor-kappa B (NF-κB) pathway upon TNF-α binding to its receptor is crucial for progression of RA. Stephanine (SA), an isoquinoline aporphine-type alkaloid recently identified in Stephania plants, exhibits anti-inflammatory properties, but its underlying mechanisms of action are unknown at present. In this study, we explored whether SA could ameliorate RA through inhibition of the NF-κB signaling pathway in association with TNF-α activity. Our experiments revealed a binding affinity (KD) of SA for TNF-α of 2.934 × 10−6 mol/L. Additionally, SA at a concentration of 10 μmol/L effectively hindered the binding of TNF-α to its receptors tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1) and TNFR2. In vitro, SA prevented TNF-α-induced death of L929 cells and blocked NF-κB activation triggered by TNF-α in 293-TNF-α responsive, as well as human fibroblast-like synoviocytes (HFLS) and human RA fibroblast-like synoviocytes (MH7A) cell lines. Furthermore, in a collagen-induced arthritis (CIA) mouse model, SA alleviated the symptoms of RA through suppression of NF-κB signaling. Our collective findings support the therapeutic efficacy of SA, a natural compound targeting TNF-α, in the management of RA.

Reference:

LIU T T, DUAN M Y, LI J, et al. Stephanine interacts with TNF-α to block NF-κB signaling and protects against rheumatoid arthritis[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(7): 9250551. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250551.

本文编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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