用于发育毒性评估的新方法（NAMs）法规要求、监管态度、动物替代场景、实践现状和案例分享

作为“标准”动物模型的替代方案，新方法（NAMs）目前是毒理学领域的热点议题。在部分毒理学评估领域（如皮肤刺激性测试），这种方法转型已取得成功。因为皮肤刺激测试系统相对独立、静态，且暴露周期有限。然而，将基于NAMs的方法用于药品胚胎-胎儿发育（EFD）终点评估（即发育毒性NAMs）并获得监管认可，却面临更大挑战，部分原因在于发育过程中胚胎与胎盘的动态变化（如基因表达、组织类型、形态结构），以及药物对母体生理状态的影响可能间接作用于胚胎-胎儿。

其实，早在20世纪80年代，多种发育毒性NAMs就已被开发出来，并在过去20余年中被制药企业用于早期筛选。其中，小鼠胚胎干细胞试验（mEST）、大鼠全胚胎培养（rWEC）、斑马鱼胚胎发育毒性试验（ZEDTA）、微团（MM）胚胎毒性试验及非洲爪蟾胚胎致畸试验（FETAX）的研究较为深入。此外，线虫、原肠胚等体外模型，乃至计算机模拟模型也已出现并经过独立评估，包括Toxys、Stemina在内的多种人干细胞试验，也已被评估可作为发育毒性NAMs使用。

尽管mEST、rWEC和MM试验已通过欧洲替代方法验证中心（ECVAM）的胚胎毒性验证，但当前使用者可能会对这些试验进行改良，以提高其在特定应用场景下的预测性。然而，后续针对mEST预测模型的研究显示，在药品应用场景中，该统计模型的预测性大幅下降。

在美国，替代方法验证跨机构协调委员会（ICCVAM）对FETAX试验的发育毒性预测能力进行了评估，最终认为该试验存在灵敏度问题及多项实际应用限制，未予采纳。此外，尽管斑马鱼胚胎试验、人干细胞基试验作为发育毒性NAMs的灵敏度和特异性已得到验证，但均未通过ICCVAM/ECVAM的官方验证。

由于这类跨实验室验证工作耗时且结果不确定，行业已逐渐偏离该验证模式，转而聚焦于实验室内部的试验资格认定。这一过程需与企业特定项目组合相匹配，并在内部验证中明确试验的使用场景。这种资格认定方式与ICH S5(R3)及各地区关于3R方法（替代、减少、优化）资格认定的指导原则建议一致。

本文将重点围绕以下内容展开：药品开发中发育毒性NAMs的当前发展格局与应用现状；相关监管框架；为何尽管ICH S5(R3)修订版指南提供了机遇，制药企业在监管申报中仍较少采用发育毒性NAMs；发育毒性NAMs成功应用的案例；以及关于如何在监管场景中进一步推广NAMs应用的建议。

ICH S5(R3)指南解读

ICH S5(R3)指南核心内容

ICH S5(R3)指南并未认可或讨论特定的试验或方法，而是明确了发育毒性新方法（Dev Tox NAMs）应具备的特征，以及NAMs测试策略资格认定需遵循的标准。为协助所有实验室开展NAMs资格认定，指南列出了若干可使用的参考化合物：包括29种已证实可在哺乳动物中诱导EFD毒性的化合物（其中18种为明确人类致畸物，2种为推定致畸物），以及3种非致畸物（用于评估NAMs的特异性）。指南还提供了这些化合物的人类暴露水平、大鼠和兔的暴露水平，以及在LOAEL及更高剂量下各种属观察到的不良发现，为NAMs中的浓度-反应关系研究提供支持。这些参考化合物的选择依据是：它们涵盖了与EFD效应相关的多种已知作用模式和理化性质，且拥有高质量的公开数据。

监管视角的重大转变：从ICH S5(R2)到ICH S5(R3)

ICH S5(R3)体现的监管视角转变意义重大。在Dev Tox NAMs的风险评估角色上，旧版指南ICH S5(R2)认为：“NAMs缺乏发育过程的复杂性及母体与发育中生物体间的动态相互作用。故无法为风险/暴露评估提供依据”。这一表述被广泛解读为：NAMs通常不适用于EFD风险评估，仅可用于药物发现早期的候选药物筛选，或用于理解动物实验中观察到的效应机制。

而ICH S5(R3)则指出：“若经过适当的资格认定，NAMs有望在（特定情况下）推迟或替代传统体内研究”。这标志着监管机构对“NAMs用于药品EFD风险表征与沟通”的适用性认知发生了根本性转变。

视角转变的依据

尽管人类对“导致胚胎-胎儿异常的分子和细胞过程”的理解有所深化，预测EFD毒性的NAMs科学基础也不断进步，但ICH S5(R2)指出的NAMs局限性仍在很大程度上适用于当前的NAMs技术。真正的转变在于：药品监管机构（HAs）认识到在特定使用场景下，Dev Tox NAMs能够提供足以支撑风险判断的信息。这些使用场景旨在支持NAMs的开发与应用，同时降低NAMs出现假阳性或假阴性结果的潜在后果。两种结果均可能因不同原因危害患者安全（例如，假阳性可能限制育龄患者用药，假阴性可能误判风险）。

ICH S5(R3)中Dev Tox NAMs的应用场景

ICHS5(R3)明确了若干“经适当资格认定的Dev Tox NAMs可支持药品开发与上市”的场景（如下表所示）。其中影响最深远的一项规定是：基于“经资格认定的替代试验结果”及“一个第二种种属的初步体内EFD研究结果”，允许在I期和II期临床试验中纳入育龄期女性（WOCBP）（最多150名，持续时间不超过3个月）。但截至目前，FDA、EMA、PMDA均未收到任何此类资格认定申请材料。

用更直白点的话总结下这个表格里面几个关键点。如果是比较确定靶点具有EFD毒性，比如PD-1抗体，非常明确的阳性结果。体外NAM方法如果是阳性，则无需开展动物研究进一步确认。如果阴性或不确定，则1个种属EFD阳性即可判定阳性。但这种情况想说明EFD阴性，则必须两个种属体内研究结果支持，毕竟靶点或同类产品层面已经提示了极高风险。对于类似ICH S9中的肿瘤或其他危及生命的疾病，要求自然就低一些。体外NAM阴性，则再开展1个种属体内研究，阴性则结果判定为阴性，阳性也参照同样原则。

WoE的应用与风险容忍度考量

ICH S5(R3)的另一核心关注点是“WoE”的使用，包括动物和人类文献、其他与风险评估相关的公开数据。若某化合物的标准治疗方案和/或证据权重显示其具有“与靶点相关的发育毒性风险”，则默认开发中的同类化合物存在相同靶点风险，除非有证据证明并非如此。若无需基于发育毒性区分该化合物与标准治疗方案，则Dev Tox NAMs可基于证据权重为“预期的EFD毒性”提供支持，无需开展动物研究。在此有限场景下，使用Dev Tox NAMs作为发育毒性证据权重评估的一部分时，可能无需遵循ICH S5(R3)附件2中严格的资格认定标准。这点比较容易理解，已经从靶点或作用机制层面判定了产品具有很高的EFD毒性风险，Dev Tox NAMs更多的是用于锦上添花，多一些证据确证下这一结论，要求就会低一些。

另一方面，对于EFD风险容忍度低的项目（例如，育龄期女性占比高的患者群体），尽早识别EFD风险至关重要。因为在药物开发后期发现意外EFD信号可能极具破坏性（如可能导致临床暂停）且成本高昂。在此背景下，项目团队通常会选择开展“最具确定性的人类安全性评估”（目前可能更倾向于体内EFD研究而非NAMs）。但尽管存在局限性，在某些情况下，Dev Tox NAMs仍可替代当前的标准动物研究。

当前实践现状

要推动NAMs在候选药物监管评估中的应用，需先明确制药企业不愿使用NAMs的原因。表面上看，NAMs为制药企业带来诸多优势，包括减少动物使用、加快决策速度及降低药物开发项目成本。但这些优势需结合整个药物开发流程综合权衡。

例如，尽管ICH S5(R3)规定了Dev Tox NAMs的使用场景，但行业普遍认为ICH S5(R2)中指出的NAMs局限性仍适用于当前技术。因此，当药物开发后期需纳入更多WOCBP，通常仍需开展两种种属的EFD研究。除非该项目符合上表所述的有限场景。这对药物开发团队有何影响？支持III期临床试验通常需要两项完整的EFD研究（ICH S9指南范畴除外），因此对大多数项目而言，上述场景下Dev Tox NAMs的主要价值仅在于将两项完整EFD研究的需求推迟到开发后期。简言之，只是延迟，并未豁免！部分企业对NAMs预测性缺乏信任，可能不愿将未知风险留到投资更高的开发后期，更倾向于尽早通过关键EFD研究结果排除风险，因此可能选择开展体内EFD研究而非使用NAMs。然而，若药物后期因其他毒性或临床原因失败，前期投入的关键EFD评估成本可能白费——但制药企业往往更倾向于做出此类风险/收益决策，而非通过更具成本效益的NAMs数据推进化合物的监管申报。

制药企业的应用与观点

目前，Dev Tox NAMs的主要应用场景是开发早期的候选化合物筛选，尤其是当目标人群为育龄期或妊娠期人群（如疟疾、血吸虫病治疗药物）。这一结论得到了近期健康与环境科学研究所（HESI）的发育与生殖毒理学（DART）委员会调查结果的支持。

调查显示，约50%的受访制药企业表示在内部将Dev Tox NAMs用作筛选试验，但目前尚无企业将其替代两种种属的体内EFD测试。其中，斑马鱼胚胎发育毒性试验（ZEDTA）是最常用的筛选和优先级排序试验；近期有研究表明，纳入生物利用度评估可提高斑马鱼幼虫致畸性试验的灵敏度和准确性，使其成为该试验的重要补充。其他常用方法还包括Stemina的Dev Tox quick Predict、Toxys的Repro Tracker、mEST、hEST及rWEC。

监管机构和制药工业界一致认为，Dev To xNAMs要最终替代体内EFD测试，还需补充更多信息，包括：Dev Tox NAMs与体内不良结果的生物学关联理解、适用范围明确、试验的转化性与预测性验证。除数据需求外，进一步推广还面临其他障碍。比如，制药企业指出，内部能力有限、缺乏开发Dev Tox NAMs的商业案例；现有试验组合无法覆盖胚胎-胎儿发育的所有方面，且技术成熟度不足以准确预测妊娠结局；经资格认定的Dev Tox NAMs使用场景有限，进一步限制了其应用。

目前行业普遍认为，监管机构尚未广泛接受将NAMs作为第二种种属试验的替代方案。未开展Dev Tox NAMs研究的企业通常更愿意在第二种种属中开展妊娠动物研究，因其认为动物试验比一种或多种NAMs更具预测性。不过，少数开展Dev Tox NAMs研究的企业已开始在提交关键两种种属体内评估数据的同时附上NAMs数据，以体现数据透明度。但此类额外NAMs数据提交不属于ICH指南建议范畴，因此很少有企业愿意生成非监管申报必需的额外数据，导致企业在这方面的参与度和动力有限。

尽管部分企业会在开发早期（通常无需DART评估时）、或结合GLP体内EFD研究、或在上市申请补充材料中提交NAMs数据，但要使Dev Tox NAMs数据提交成为常规操作，仍需更多数据证明其与标准种属EFD研究的等效性及监管认可度。迄今为止，公开的NAMs与EFD研究的真实世界对比数据有限，这表明仍需更多工作建立行业信任。只有当获得可靠的对比数据后，新的Dev Tox NAMs数据提交才能获得足够信任以接受适当评估。无论对错，制药行业都在等待这一范式转变，之后才会将NAMs常规用于监管申报。

区域资格认定途径

FDA

在美国FDA，可通过两种方式评估Dev Tox NAMs是否适合特定使用场景：一是通过正式资格认定程序，认定后NAMs可被广泛（跨药企）使用；二是通过向IND提交数据进行非正式评估，此时FDA将根据具体情况判断NAMs是否符合申办方提出的特定用途。

从减少安全测试中动物使用的潜力来看，更具影响力的是将NAMs正式认定为药物开发工具（DDT）。一旦通过认定，DDT将公开可用，可用于任何符合认定使用场景的药物开发项目，且在提交IND、NDA或BLA时，FDA无需重新评估其是否适合已认定的使用场景。FDA已发布指南，明确了DDT正式资格认定的评估流程。

EMA

在EMA，试验开发者可通过创新工作组（Innovative Task Force）初步探讨基于NAMs的特定策略可能性，随后通过科学建议程序进一步推进。NAMs策略在特定使用场景下的资格认定，需通过人用药品委员会（CHMP）启动的资格认定程序完成。

此外，申办方可通过3R测试方法自愿数据提交（VSD），将3R相关数据与现有方法生成的数据一并提交。此类提交的数据不用于监管决策，仅作为信息供监管机构参考，为未来的资格认定和/或使用场景考量积累数据。

PMDA

PMDA目前尚无专门的NAMs资格认定咨询项目。希望在药物开发中使用NAMs的申办方，需在药物开发咨询中讨论NAMs的资格认定问题。

Dev Tox NAMs的当前应用案例

尽管目前尚无Dev Tox NAMs用于替代/减少动物试验并获得监管认可的实例，但该方法在药物开发各阶段的应用已取得一定进展。以下为若干Dev Tox NAMs的应用案例，其中部分案例的数据已提交至监管机构。

案例1：Stemina公司Dev Tox quick Predict（devTOXqP）试验——监管申报中的资格认定尝试

通过检索CDER和CBER药物开发工具（DDT）资格认定项目数据库（https://force-dsc.my.site.com/ddt/s/）发现，目前仅有一项以“减少EFD评估中动物使用”为目标的Dev Tox NAMs提交至FDA的DDT项目，即Stemina公司针对其Dev Tox quick Predict（devTOXqP）试验的申报。该试验的意向书（LOI）及FDA的意向书决定书均可在生物标志物资格认定网站查询（项目编号：DDT-BMQ-000109）。

Stemina在初始意向书中提议，将试验输出指标“培养基中鸟氨酸与胱氨酸的比值”认定为“在药物开发非临床阶段，利用人多能干细胞体外检测小分子候选药物人类发育毒性潜力的安全生物标志物”。FDA审核后接纳了该申请，但大幅缩小了其使用场景：“鸟氨酸与胱氨酸的比值可作为安全生物标志物，在药物开发非临床阶段，利用人多能干细胞体外检测小分子药物的人类发育毒性潜力，并作为ICH S5(R3)指南所述WoE评估的一部分”。FDA指出：“该试验及生成的生物标志物无法满足替代试验的这一标准，但可作为EFD毒性证据权重评估的额外数据点”。因此，devTOXqP无法作为动物EFD的替代试验，仅能作为证据权重评估的组成部分。说白了，还是锦上添花。

案例2：Dev Tox NAMs用于EFD研究前置——疟疾药物开发中的早期筛选

为识别对人类致畸潜力低的药物，疟疾药物研发机构（MMV）及其合作伙伴建立了Dev Tox NAMs筛选策略，旨在将监管要求的体内EFD试验前置到药物开发早期，以便更早对候选化合物进行优先级排序。这对开发适用于孕妇及育龄期女性的安全抗疟药至关重要。MMV通过在抗疟药研究中积累NAMs数据，助力ICH S5指南更快、更顺畅地应用于监管决策。

为避免药物开发后期因临床暂停产生的成本及减少动物使用，MMV采用ZEDTA和Toxys Repro Tracker检测抗疟药的发育毒性潜力：

若任一或两项NAMs结果为阳性，则尽早开展啮齿类初步EFD剂量探索研究（pEFD），通过胎儿外观评估和内脏检查验证NAMs结果；若pEFD研究证实化合物具有发育毒性，则重新评估其开发方向（可能转向其他临床人群）；

若所有NAMs均未检测到发育毒性信号，则仅在药物开发后期（通常在I期临床试验结果获得后）开展啮齿类和非啮齿类EFD研究。

案例3：Dev Tox NAMs用于风险降低——临床前危害识别

某制药企业曾采用两种Dev Tox NAMs进行危害识别，以降低临床前化合物的MEFL风险，分别为mTEST和rWEC试验，二者同步开展。选择两种NAMs的原因是，目前尚无单一NAMs能涵盖哺乳动物宫内发育的所有生物学复杂性，需通过组合覆盖不同发育阶段。

然而，在实际应用中，mTEST对大鼠MEFL的预测性欠佳，即mTEST筛选后开展的大鼠pEFD/EFD研究结果与预测不符，且其预测模型无法确定“大鼠pEFD/EFD研究中可能出现MEFL的体内暴露阈值（如母体Cmax）”。因此，该企业目前选择rWEC作为主要危害识别工具，若rWEC预测结果结合人类暴露目标、患者人群等因素提示风险，则加速开展pEFD研究验证预测结果。

案例4：Dev Tox NAMs用于补充体内研究——克服传统动物模型局限性

卡巴米喹是一种处于II期临床试验的抗疟药（与咯萘啶联用，临床试验编号：NCT05689047、NCT05974267）。在评估其致畸潜力时，研究人员采用ZEDTA模型克服了传统动物模型中“母体效应（如体重、进食量变化）限制高剂量测试”的问题。此外，研究还监测了胚胎发育过程中药物在斑马鱼体内的摄取情况，评估暴露水平并计算关键药代动力学参数（AUC、Cmax）。通过将这些参数与动物体内暴露及预测人类暴露进行对比，明确了安全边际，最终得出“卡巴米喹无致畸性，可用于孕期第一阶段”的结论。

案例5：Dev Tox NAMs补充WoE的理论应用场景

假设某晚期癌症治疗药物的靶点已有WoE提示可能导致MEFL，包括“基因敲除（KO）小鼠存活率降低且伴随心脏损伤”的数据。针对该化合物，可采用含“人诱导多能干细胞分化为心肌细胞”的Dev Tox NAMs进行评估：

若观察到心肌细胞随时间发生预期变化（基因表达、形态/功能改变），则可基于作用机制及“人类相关测试系统中候选药物的实验数据”，为MEFL风险的证据权重提供支持。若观察到的效应与靶点相关文献一致，且该靶点与药物疗效所需靶点相同，则可认为其与人类相关；此外，还可通过体外效应阈值评估及生理药代动力学（PBPK）建模，进一步明确人类暴露下的潜在风险。

在此案例中，Dev Tox NAMs无需符合ICH S5(R3)所述的监管资格认定标准——因其仅用于验证已有证据权重的结论，只需确保测试系统的预测性足够可靠即可。而当证据权重不足或不明确时，Dev Tox NAMs的监管资格认定可增强结果可信度。

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