PNAS I RIPK1泛素化“生死开关”被揭示：一端掌控胚胎发育，一端点燃系统性炎症 (章海兵-中国科学院上海营养与健康研究所)

2026年4月7日，中国科学院上海营养与健康研究所章海兵团队 在PNAS（中科院1区，IF=9.1）在线发表题为 “RIPK1 ubiquitination regulates its kinase-independent function in development and inflammation” 的研究论文。该研究聚焦 RIPK1泛素化调控细胞死亡与炎症反应 这一免疫炎症领域关键问题，围绕 RIPK1 K376 位点泛素化在胚胎发育、炎症小体活化和系统性炎症中的作用及机制展开系统研究。

研究团队此前发现，RIPK1 K376 位点泛素化缺失会导致小鼠胚胎致死，并伴随过度细胞死亡。为进一步区分 RIPK1 激酶活性和支架功能在该过程中的作用，本研究在 Ripk1^K376R/K376R 小鼠基础上引入激酶失活突变 D138N，构建 Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 双突变小鼠。结果显示，D138N 突变可完全挽救 K376R 小鼠的胚胎致死，说明 K376 位点泛素化缺失导致的胚胎死亡主要依赖 RIPK1 激酶过度活化。

值得关注的是，虽然双突变小鼠能够存活至成年，但出生后出现明显系统性炎症，主要表现为皮肤和肝脏炎症、脾肿大、中性粒细胞增加以及炎症相关基因上调。进一步遗传学分析显示，敲除 Caspase-1/11 可显著缓解炎症，而敲除 Trif 无法改善，提示该炎症过程主要由炎症小体活化驱动，而非经典 TRIF 信号介导。

机制上，该研究发现，RIPK1 K376R 突变可通过激酶非依赖性、支架依赖性方式激活内源性 NLRP3 炎症小体，促进 Caspase-1 活化和 IL-1β 分泌。进一步分析显示，该过程与 ROS 增加、线粒体功能异常和花生四烯酸代谢重编程密切相关。Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 巨噬细胞中 PGE2 和 PGD2 等前列腺素显著升高，COX1/2 抑制剂可抑制 IL-1β 分泌并改善 LPS 诱导的小鼠死亡，说明花生四烯酸-COX-前列腺素通路是 RIPK1 支架驱动炎症的重要代谢轴。

进一步研究揭示，RIPK1 可与 RIPK3 和 COX2 形成复合物，促进 COX2 活化和 PGE2 生成。该过程依赖 RIPK3 的 RHIM 结构域，但不依赖 RIPK3 激酶活性，也不依赖坏死性凋亡执行分子 MLKL。与此一致，敲除 Ripk3 而非 Mlkl 可显著缓解双突变小鼠的系统性炎症，提示存在一条 RIPK1/RIPK3-COX2-PGE2-NLRP3-IL-1β 的非经典炎症通路。

该研究系统阐明了 RIPK1 K376 位点泛素化在发育和炎症中的双重调控作用：一方面，RIPK1 激酶活性驱动胚胎发育阶段的细胞死亡；另一方面，RIPK1 支架功能可在成年阶段通过代谢重编程和炎症小体活化诱发系统性炎症。该发现为理解 RIPK1 相关炎症性疾病提供了新的机制框架，也为开发选择性靶向 RIPK1 支架功能或下游炎症代谢轴的新型抗炎策略提供了重要理论依据。

亮点：

RIPK1 是细胞凋亡、坏死性凋亡和炎症反应的核心调节因子，其不同功能取决于其支架作用和激酶活性。RIPK1 的翻译后修饰，尤其是泛素化，对于控制其活化至关重要。

本研究发现，RIPK1 第376位赖氨酸泛素化缺失不仅通过 RIPK1 激酶依赖性细胞死亡导致胚胎致死，还可在成年小鼠中通过一种激酶非依赖性、支架依赖性机制驱动系统性炎症。这种炎症反应由 RIPK3 依赖性炎症小体活化及随后的 IL-1β 分泌介导，同时 TNFR1 诱导的细胞死亡也参与其中。

这些发现揭示了 RIPK1 在发育和炎症调控中的双重作用，并为理解 RIPK1 相关炎症性疾病的发病机制提供了新的概念框架。

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【摘要】

受体相互作用蛋白激酶1（Receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）是细胞死亡和炎症反应的关键调控因子，其活化受到多种翻译后修饰调控。此前研究表明，RIPK1 第376位赖氨酸（K376）的泛素化可在体内外抑制细胞凋亡和坏死性凋亡，但其在炎症中的作用仍不明确。

本研究在 Ripk1^K376R/K376R 小鼠中引入激酶失活突变 D138N。值得注意的是，Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 小鼠可挽救 Ripk1^K376R/K376R 小鼠的胚胎致死表型，但出生后会发生系统性炎症。进一步研究发现，联合敲除 Caspase-1/11 可显著缓解这种炎症，而敲除 Trif 则不能，提示炎症小体活化在其中发挥关键作用。

机制上，RIPK1 K376 位点泛素化缺失可促进依赖 RIPK1 激酶活性的细胞死亡，这是 Ripk1^K376R/K376R 小鼠胚胎致死的原因。同时，K376R 突变还可通过触发内源性 NLRP3 炎症小体活化和下游 IL-1β 分泌，驱动 RIPK1 激酶非依赖性炎症反应。

进一步研究发现，RIPK1 通过 RIPK3 依赖性机制促进这一过程。与此一致，敲除 Ripk3 而非 Mlkl 可改善炎症，提示存在一条不依赖坏死性凋亡的炎症轴。

综上，本研究表明，RIPK1^K376R 突变体不仅在胚胎发育过程中诱导依赖激酶活性的细胞死亡，还可在成年阶段通过 RIPK3 介导的代谢重编程激活 NLRP3 炎症小体，从而促进激酶非依赖性、支架功能驱动的炎症反应。

关键词

RIPK1；Caspase-1/11；NLRP3炎症小体；泛素化

01

研究背景及科学问题

受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调控细胞死亡、炎症和免疫反应。在人类中，RIPK1 双等位基因功能缺失突变可导致严重免疫缺陷以及早发炎症性疾病，如炎症性肠病和关节炎。在小鼠中，Ripk1 缺失会导致围产期死亡，这主要是由于 FADD/Caspase-8 介导的异常凋亡，以及 RIPK3/MLKL 轴驱动的坏死性凋亡失控所致。

RIPK1 的激酶活性对于 RIPK1 依赖性凋亡和坏死性凋亡均不可或缺。然而，在小鼠中通过 D138N 或 K45A 等激酶失活突变使 RIPK1 失去催化活性，并不会影响正常存活。事实上，这类激酶突变小鼠对 TNFα 诱导的系统性炎症反应综合征及多种神经退行性疾病具有抵抗作用，提示 RIPK1 激酶活性不仅参与细胞死亡，也参与病理性炎症过程。

与此同时，Caspase-8 对 RIPK1 的切割是防止其异常活化的重要检查点。一旦 RIPK1 不能被 Caspase-8 正常切割，就会引发自发性炎症和致死表型，而抑制 RIPK1 激酶活性可部分挽救这一表型。这些结果提示，活化的 RIPK1 可能通过超越其激酶活性的机制促进炎症。

遗传学研究显示，在 RIPK1 D324A 突变背景下引入激酶失活突变可完全挽救胚胎致死，但双突变小鼠最终仍会死亡，且不能存活至断奶后。这说明活化的 RIPK1 可通过激酶非依赖性信号通路介导炎症功能。另有研究显示，在凋亡和坏死性凋亡被抑制时，催化失活的 Caspase-8 可通过其支架功能促进细胞焦亡。然而，RIPK1 是否也可通过支架功能参与炎症小体活化或炎症重编程，目前仍不清楚。

RIPK1 的泛素化状态对于其多种功能转换至关重要。既往研究报道，RIPK1 可在多个位点发生泛素化，包括 K376、K115、K627 等，其中 K376 位点在人源 RIPK1 中对应 K377，对调控 RIPK1 活化尤为关键。体外研究表明，K377R 突变会抑制 TNFα 介导的 NF-κB 活化，并促进 TNFα 诱导的凋亡。

研究者此前及其他团队已证明，表达 RIPK1 K376R 突变体的小鼠会在胚胎第12.5天发生胚胎致死，并伴随胚胎组织和卵黄囊中过度细胞死亡。通过遗传杂交策略，敲除凋亡和坏死性凋亡相关基因，如 Fadd/Ripk3、Fadd/Mlkl 或 Casp8/Ripk3，可完全挽救 Ripk1^K376R/K376R 小鼠的胚胎致死，提示 RIPK1 K376R 在胚胎发育中同时促进凋亡和坏死性凋亡。

虽然体外实验显示 RIPK1 K376R 诱导的细胞死亡依赖其激酶活性，但给予 RIPK1 激酶抑制剂 Nec-1 仅能将胚胎死亡从 E12.5 延迟至 E13.5。因此，RIPK1 K376R 突变引起的胚胎致死是否真正依赖激酶活性仍不明确。

本研究构建了 Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 双突变小鼠模型，在 K376R 背景下引入激酶失活 D138N 突变。结果发现，该双突变小鼠可挽救 Ripk1^K376R/K376R 小鼠的胚胎致死，但出生后会发生自发性系统性炎症。

进一步遗传学分析显示，这种炎症可被 Caspase-1/11 缺失挽救，而不能被 TRIF 缺失挽救，提示炎症小体内源性活化在其中发挥关键作用。机制上，RIPK1 K376R 突变既可驱动依赖激酶活性的细胞死亡，也可驱动激酶非依赖性炎症反应。当活化的 RIPK1 通过 RIPK3 重编程花生四烯酸代谢时，可导致前列腺素过量产生，进而激活内源性 NLRP3 炎症小体并促进 IL-1β 分泌。

总体而言，本研究揭示，RIPK1 K376R 突变体不仅在胚胎发生期间促进依赖激酶活性的细胞死亡，也可在出生后促进激酶非依赖性炎症反应。

02

重要发现及亮点

1. Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 小鼠可挽救 Ripk1^K376R/K376R 小鼠胚胎致死，但会发生系统性炎症

研究者此前及其他团队已经证明，Ripk1^K376R/K376R 小鼠的胚胎致死可通过同时消除凋亡和坏死性凋亡相关基因得到完全挽救；同时，在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，RIPK1 K376R 诱导的细胞死亡依赖其激酶活性。然而，Nec-1 给药仅能将胚胎死亡从 E12.5 延迟至 E13.5。为进一步解析 RIPK1 激酶活性在 RIPK1^K376R 诱导胚胎致死中的作用，研究构建了携带 K376R 和 D138N 双突变的敲入小鼠，即 Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N，简称 Ripk1^K,D/K,D。其中关键激酶残基 D138 被天冬酰胺 N138 替代。

与 E12.5 即死亡的 Ripk1^K376R/K376R 小鼠不同，Ripk1^K,D/K,D 小鼠可存活至成年，说明 Ripk1^K376R/K376R 小鼠的胚胎致死主要由 RIPK1 激酶过度活化驱动。

为研究 RIPK1 激酶失活对 K376R 突变诱导细胞死亡的影响，研究者使用 Ripk1^+/+、Ripk1^K376R/K376R 和 Ripk1^K,D/K,D 小鼠来源的永生化 MEF 细胞，并给予不同细胞死亡刺激。结果显示，Ripk1^K376R/K376R MEF 对 TNFα+BV6 诱导的凋亡，以及 TNFα+BV6+zVAD 诱导的坏死性凋亡高度敏感；而 Ripk1^K,D/K,D MEF 可抵抗这两类细胞死亡。

进一步研究 TNFα 刺激后 TNF-RSC 复合物发现，与 Ripk1^K376R/K376R MEF 相比，Ripk1^K,D/K,D MEF 中升高的 p-RIPK1(S166) 被抑制，但降低的 RIPK1 泛素化并未恢复。相应地下游细胞死亡执行标志物，包括 cleaved Caspase-3、p-MLKL 和 p-RIPK3，在 Ripk1^K,D/K,D MEF 中均下降。

由于 RIPK1 对 NF-κB 信号的调控主要依赖其泛素化功能而非激酶活性，研究发现 Ripk1^K,D/K,D MEF 在 TNFα 刺激下仍表现出与 Ripk1^K376R/K376R MEF 类似的 NF-κB 活化缺陷。这说明 D138N 激酶失活可抑制 RIPK1 活化并保护细胞免于死亡，但不能恢复 TNFα 处理 Ripk1^K376R/K376R 细胞中下降的 RIPK1 泛素化。

尽管 Ripk1^K,D/K,D 小鼠可以存活，但其表现出进行性生长迟缓和体重降低。组织病理学分析显示，Ripk1^K,D/K,D 小鼠在皮肤和肝脏中出现自发性炎症，而肺和肠道组织未见明显炎症。2周龄时 Ripk1^K,D/K,D 小鼠脾脏外观正常，但8周龄时出现脾肿大。免疫细胞分析显示，脾脏中 CD3^+ T 细胞减少，B220^+ B 细胞和 Gr-1^+CD11b^+ 中性粒细胞增加，提示发生系统性炎症反应。

皮肤组织 RNA-seq 显示，Ripk1^K,D/K,D 小鼠炎症相关基因，如 Il1b、Il6、Cxcl2、Acod1，以及细胞死亡相关基因，如 Casp4、Nlrp3、Ripk3、Mlkl 显著上调。差异基因聚类分析发现 subcluster_1 基因集在 Ripk1^K,D/K,D 皮肤组织中显著上调，其功能富集主要与免疫反应和免疫细胞募集通路相关。RT-PCR 进一步验证了代表性炎症因子的表达升高，而 Tnfa 表达未发生明显变化。

为检测 RIPK1 支架蛋白剂量是否影响炎症，研究者分析了缺失一个 RIPK1 等位基因的 Ripk1^K,D/− 小鼠。结果显示，该小鼠表型正常，未出现 Ripk1^K,D/K,D 小鼠中的炎症病理，炎症和细胞死亡基因表达也恢复正常。这说明需要两个拷贝的 RIPK1 支架蛋白，才能通过激酶非依赖性功能驱动系统性炎症。

图1 Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 小鼠发生系统性炎症

A：构建 Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 小鼠的策略示意图；
B：Ripk1^K376R,D138N/+,+ 小鼠互交后断奶后代数量统计；
C：出生后第14天不同基因型小鼠代表性图像；
D：出生后第14天不同基因型小鼠皮肤切片的 H&E、IHC（CD45）和免疫荧光染色图像，其中 K6 为绿色、K10 为红色；
E：8周龄小鼠脾脏/体重比值，以及脾脏中 Gr-1^+CD11b^+、B220^+、CD3^+、CD4^+ 和 CD8^+ 细胞数量统计；
F：RNA-seq 火山图显示差异表达基因；
G：实时 PCR 检测皮肤组织炎症相关基因表达；
H：不同基因型皮肤组织中 subcluster_1 基因集趋势图。
K,D 表示 Ripk1^K376R,D138N。数据以均数 ± SEM 表示，采用双尾 Student’s t 检验；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2. Caspase-1/11 信号加重 RIPK1 支架驱动的系统性炎症

鉴于 RIPK1 激酶失活突变可抑制凋亡和坏死性凋亡，而 Ripk1^K,D/K,D 小鼠皮肤和血清中 IL-1β 表达升高，研究进一步检测焦亡相关信号通路是否被活化。

Western blot 结果显示，Ripk1^K,D/K,D 小鼠皮肤中 Caspase-11、cleaved GSDMD 和 cleaved Caspase-1 水平均升高，但其他组织中未出现相同变化。

由于 Ripk1^K,D/K,D 小鼠皮肤中存在炎症小体活化，研究者将该小鼠分别与 Trif^−/− 和 Casp1/11^−/− 小鼠杂交，以确定焦亡通路在皮肤炎症中的作用。组织学结果显示，敲除 Casp1/11 而非 Trif，可显著减少皮肤和肝脏中的表皮增厚及免疫细胞浸润。

在8周龄时，Casp1/11 缺失的 Ripk1^K,D/K,D 小鼠还表现出脾肿大减轻和中性粒细胞积累减少。考虑到焦亡在 LPS 诱导内毒素休克中的关键作用，研究者进一步给予 Ripk1^K,D/K,D 小鼠致死剂量 LPS，以评估 RIPK1 支架功能在该模型中的作用。结果显示，Ripk1^K,D/K,D 小鼠在 LPS 诱导内毒素休克模型中死亡率显著高于野生型小鼠。

既往研究报道，敲除 Trif 或 Casp1/11 均可增强小鼠对 LPS 诱导内毒素休克的抵抗力。然而在本研究中，只有 Casp1/11 缺失，而不是 Trif 缺失，能够降低 Ripk1^K,D/K,D 小鼠在 LPS 诱导内毒素休克中的高敏感性。以上结果表明，Casp1/11 介导的炎症小体活化，而非 TRIF 信号，是 RIPK1 支架依赖性炎症和 LPS 内毒素休克易感性的主要贡献因素。

图2 Caspase-1/11 信号参与 RIPK1 支架介导的系统性炎症

A：Western blot 检测出生后第14天不同基因型小鼠皮肤组织中相关蛋白表达；
B：出生后第14天不同基因型小鼠代表性图像；
C：2周龄不同基因型小鼠皮肤和肝脏切片代表性图像；
D：2周龄不同基因型小鼠皮肤表皮厚度、炎症面积和 CD45^+ 细胞数量统计；
E：脾脏重量定量；
F：8周龄不同基因型小鼠脾脏代表性图像；
G–H：流式细胞术检测8周龄不同基因型小鼠脾细胞中 Gr-1 和 CD11b 阳性细胞；
I：LPS（50 mg/kg）攻击后不同基因型小鼠生存曲线。
生存曲线比较采用 Log-Rank（Mantel–Cox）检验；D、E、H 图数据以均数 ± SEM 表示，采用双因素方差分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3. RIPK1^K376R 突变促进内源性 NLRP3 炎症小体活化

基于 Casp1/11 敲除可显著挽救 Ripk1^K,D/K,D 小鼠系统性炎症这一发现，研究者提出假设：RIPK1 的支架功能可促进 Casp1/11 介导的炎症小体活化。

为验证这一点，研究首先检测 LPS 刺激后 Ripk1^K,D/K,D 和 Ripk1^+/+ 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的细胞因子产生。结果显示，与对照组相比，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 分泌显著更高水平的 IL-1β，而 IL-6 和 TNFα 并未升高。Caspase-1 抑制剂 YVAD 可显著消除升高的 IL-1β，说明这一过程依赖 Caspase-1 活化。

鉴于 NLRP3 依赖性炎症小体可激活 Caspase-1，研究进一步使用 NLRP3 特异性抑制剂 MCC950 进行验证。结果显示，在 LPS 刺激的 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中，MCC950 可抑制 Caspase-1 活化和 IL-1β 分泌，表明这一过程由 NLRP3 炎症小体介导。

不过，在经典 NLRP3 炎症小体刺激条件下，即 LPS 加 Nigericin，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 的炎症小体活化反而低于 Ripk1^+/+ 对照细胞，这可能与 NF-κB 启动阶段缺陷导致 NLRP3 表达不足有关。这也与 Trif 敲除不能挽救 Ripk1^K,D/K,D 小鼠炎症表型的结果一致。总体来看，这些结果提示 RIPK1^K376R 突变可通过支架依赖方式促进内源性 NLRP3 炎症小体活化和 IL-1β 分泌。

为探索 RIPK1 突变如何驱动内源性 NLRP3 炎症小体活化，研究对差异表达基因集 subcluster_1 进行富集分析，发现其不仅富集于免疫活化通路，也富集于活性氧（ROS）产生相关通路。实际检测显示，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 在基础状态和 LPS 刺激后均产生更高水平 ROS。由于 ROS 是内源性 NLRP3 炎症小体的激活因子，研究进一步使用 ROS 清除剂 BHA 和 NAC 处理细胞，结果显示二者均可抑制 LPS 刺激后 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中过量 IL-1β 分泌。

由于线粒体是 ROS 的主要来源之一，研究者进一步评估线粒体完整性和功能。形态学分析显示，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中线粒体碎片化增加；TMRE 和 JC-1 染色显示线粒体膜电位显著下降，提示发生线粒体去极化。相应地，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中线粒体 ROS 在基础状态和 LPS 刺激后均升高。使用线粒体 ROS 清除剂 MitoTEMPO 可部分降低 IL-1β 分泌，说明线粒体 ROS 部分参与 RIPK1 支架下游的内源性 NLRP3 炎症小体活化。

图3 RIPK1^K376R 突变体通过激酶非依赖性功能激活内源性 NLRP3 炎症小体

A：Ripk1^+/+ 和 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 经 LPS（100 ng/mL）刺激18 h 后，检测培养上清中 IL-1β、IL-6 和 TNFα 释放；
B：在有或无 Caspase-1 抑制剂 YVAD（20 μM）的条件下，检测 LPS 刺激18 h 后 IL-1β 释放；
C–D：在有或无 NLRP3 抑制剂 MCC950（1 μM）的条件下，LPS 刺激24 h 后检测 IL-1β 释放和 cleaved Caspase-1 水平；
E–F：GO 富集分析中超氧化物代谢过程相关差异基因热图，以及 Reactome 富集分析中吞噬细胞 ROS/RNS 产生相关差异基因热图；
G：LPS 刺激不同时间后，采用 DCF-DA 染色检测 BMDMs 中 ROS 生成；
H：BHA（200 μM）和 NAC（5 mM）处理后，检测 LPS 刺激16 h 后 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 水平；
I：流式细胞术分析 LPS（100 ng/mL）刺激6 h 后 BMDMs 中 MitoSOX 信号；
J：MitoTEMPO 处理后，检测 LPS 刺激16 h 后 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 水平。
数据以均数 ± SEM 表示。A 图采用双尾 Student’s t 检验；B、C、G–J 图采用双因素方差分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

4. RIPK1 驱动花生四烯酸代谢重塑，促进前列腺素过量产生

研究数据表明，BHA 可强烈抑制 IL-1β 分泌，而 NAC 仅发挥部分抑制作用，说明 ROS 只是内源性 NLRP3 炎症小体活化的部分原因。

对 Ripk1^+/+ 和 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 进行非靶向代谢组学分析发现，脂质代谢是最显著失调的通路。LipidTOX Red 染色进一步证实，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 在 LPS 刺激后出现过量脂质积累。药理学阻断关键脂质代谢通路可显著减少 IL-1β 分泌。

既往研究显示，脂肪酸氧化参与炎症小体活化，但本研究发现，Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中脂肪酸摄取和 HADHA 酶活性并无明显变化，提示在该模型中占主导的是其他脂质代谢通路。

通路富集分析发现，花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代谢显著上调，其特征是通过 PLA2-COX1/2 信号增强前列腺素生成。考虑到 BHA 已知可抑制胞质型 PLA2（cPLA2），研究者推测 BHA 可能通过靶向 cPLA2 介导的 AA 代谢抑制 IL-1β 分泌。

为验证这一点，研究使用针对 PLA2-COX1/2 信号不同组分的抑制剂。其中 MAFP 可抑制 cPLA2 和 iPLA2，BEL 靶向 sPLA2，CAY10650 是选择性 cPLA2 抑制剂。结果显示，MAFP 的抑制作用强于 CAY10650，而 BEL 无明显作用，提示 sPLA2 不参与该过程，cPLA2 在 RIPK1 支架介导的 IL-1β 释放中发挥重要作用。

随后研究者使用选择性 COX 抑制剂验证下游 COX1/2 的作用。结果显示，这些药物均可强烈抑制 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 分泌。

接着，研究探讨 RIPK1^K376R 突变如何调控 AA 代谢以影响 IL-1β 分泌。LPS 刺激可使 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 AA 衍生代谢物，尤其是 PGE2 和 PGD2 显著升高。虽然 IL-1β 可放大 PGE2 生成，但对 Ripk1^+/+、Ripk1^K,D/K,D 和 Ripk1^K,D/K,D Casp1/11^−/− BMDMs 的分析显示，Casp1/11 敲除虽然消除了 IL-1β 分泌，却并未降低 PGE2 水平，说明 RIPK1 增强 AA 代谢和 PGE2 产生并不依赖 IL-1β 反馈。

为评估 RIPK1 活化突变是否普遍增强前列腺素合成，研究者在 RIPK1 敲除的永生化 BMDMs 中回补 RIPK1 突变体，包括 D324A、K376R 和 K612R。结果发现，在 LPS+Nec-1 条件下，所有突变体均较野生型 RIPK1 增强 PGE2 产生，说明 RIPK1 活化突变普遍增强支架依赖性 PGE2 生成。

既往研究显示，PGE2 可通过 EP3 受体激活磷脂酶 C（PLC），随后通过 IP3 受体增加细胞内 Ca^2+，并降低细胞内 cAMP。Ca^2+ 和 cAMP 均参与炎症小体活化和 IL-1β 释放。研究发现，EP3 抑制剂 L798106 可显著降低 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 分泌，提示 EP3 发挥关键作用。PLC 抑制剂 2-APB 和升高 cAMP 的 Forskolin 也均可显著抑制 IL-1β 释放。相比之下，PGD2 受体 DP1 抑制剂无明显作用。

进一步地，研究者用 PGE2 处理 Ripk1^+/+ 和 Ripk1^K,D/K,D 细胞，发现 PGE2 可浓度依赖性增强 IL-1β 分泌。同时，PGE2 处理后 Ripk1^K,D/K,D 细胞 ROS 生成增加。与此一致，COX1/2 抑制剂吲哚美辛预处理可显著挽救 LPS 诱导的 Ripk1^K,D/K,D 小鼠死亡，证明 AA-COX1/2 信号是 RIPK1 依赖性炎症的重要介质。

图4 RIPK1 协调花生四烯酸代谢重塑

A：非靶向代谢组学 OPLS-DA 得分图；
B：非靶向代谢组学差异代谢物火山图；
C：差异代谢物 KEGG 富集分析及差异丰度评分，展示前20条通路；
D：花生四烯酸代谢差异代谢物热图及 VIP 值；
E–F：在花生四烯酸代谢相关抑制剂处理后，检测 LPS 刺激16 h 后 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 水平；
G：LPS 刺激不同时间后，检测 Ripk1^+/+ 和 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 培养上清中 PGE2 释放；
H：在有或无相关抑制剂条件下，LPS 刺激9 h 后检测 PGE2 释放；
I：LPS 刺激9 h 后，不同基因型 BMDMs 培养上清中 PGE2 和 IL-1β 释放；
J：在不同 RIPK1 回补 iBMDMs 中检测 PGE2 释放，并通过 Western blot 分析 RIPK1 蛋白水平；
K：在有或无相关抑制剂条件下，LPS 刺激16 h 后检测 IL-1β 释放；
L：LPS（50 mg/kg）攻击前3 h 给予 PBS 或吲哚美辛（50 mg/kg）预处理的 Ripk1^K,D/K,D 小鼠生存曲线。
生存曲线比较采用 Log-Rank（Mantel–Cox）检验；其余数据以均数 ± SEM 表示，采用单因素或双因素方差分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

5. RIPK1/RIPK3 信号轴协调 COX2 活化

前述结果证明，RIPK1^K376R 突变可通过花生四烯酸-cPLA2-COX1/2-PGE2 轴促进支架依赖性 IL-1β 分泌。为进一步解析 RIPK1 支架功能如何调控该通路，研究首先检测 cPLA2 活化状态，即 p-cPLA2 水平。结果显示，在短期或长期 LPS 刺激下，两种基因型之间 p-cPLA2 水平均无明显差异，提示 RIPK1 不直接调控 cPLA2 活化。

同样，LPS 刺激后 COX1/2 蛋白表达也无明显改变，但 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 COX 酶活性显著升高。鉴于 COX2 抑制剂可强烈抑制 IL-1β 和 PGE2 分泌，研究者推测 RIPK1 可能直接调控 COX2。

在过表达 RIPK1 和 COX2 的 293T 细胞中进行共免疫沉淀实验，证实二者存在相互作用。截短突变分析显示，RIPK1 的激酶结构域介导其与 COX2 的结合。重要的是，激酶失活突变体 RIPK1^D138N 仍能保留与 COX2 的结合能力，说明这种相互作用依赖 RIPK1 支架功能，而不是其激酶活性。

考虑到 RIPK1 已知可通过支架功能与 RIPK3 相互作用，并且 Ripk1^K,D/K,D 皮肤组织中存在 RIPK1 与 RIPK3 结合，研究者进一步探讨 RIPK3 是否参与 RIPK1 依赖性 COX2 调控。来自 Ripk1^+/+、Ripk1^K,D/K,D 和 Ripk1^K,D/K,D Ripk3^−/− 小鼠的 BMDMs 显示，RIPK3 缺失显著降低 Ripk1^K,D/K,D 细胞中 PGE2 产生，说明该过程依赖 RIPK3。

过表达实验显示，RIPK3 而非其下游效应分子 MLKL 可与 COX2 相互作用。分子对接和突变实验表明，RIPK3 的 RHIM 结构域，而不是其激酶活性，对于 RIPK3-COX2 结合至关重要。与此一致，RIPK3 激酶抑制并不能抑制 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 分泌。

由于 RIPK3-RHIM 结构域主要与 RIPK1 的 RHIM 结构域相互作用，研究者推测 RIPK3 与 COX2 的结合可能通过 RIPK1 介导。使用 Ripk1 缺失细胞进一步分析后发现，在缺失 RIPK1 的情况下，RIPK3 无法与 COX2 相互作用，提示 RIPK3 RHIM 突变会破坏 RIPK1-RIPK3 结合，进而影响 RIPK3-COX2 相互作用。

既往研究显示，COX2 活化需要二聚化。研究发现，LPS 刺激可促进 RIPK1-RIPK3-COX2 复合物形成，并诱导 COX2 二聚化。遗传学敲除 Ripk3，而非 Mlkl，可显著抑制 Ripk1^K,D/K,D BMDMs 中 IL-1β 分泌。此外，COX2 抑制剂塞来昔布可改善 LPS 攻击 Ripk1^K,D/K,D 小鼠的生存率。

不过，COX2 抑制剂改善 LPS 诱导 Ripk1^K,D/K,D 小鼠死亡的效果弱于非选择性 COX1/2 抑制剂吲哚美辛。这可能是因为 COX1 在 COX2 抑制后具有代偿作用。由于 COX1 和 COX2 具有重叠的催化活性和结构相似性，COX1 是否也以 RIPK1 依赖方式参与该通路仍需进一步研究。

总体而言，这些结果表明，RIPK1 和 RIPK3 可通过支架依赖性相互作用协同调控 COX2 活化，促进 PGE2 和 IL-1β 产生。该机制依赖 RIPK3 的 RHIM 结构域，代表了 RIPK1-RIPK3 复合物在炎症信号中一种激酶非依赖性、非经典功能。

图5 RIPK1/RIPK3 与 COX2 形成复合物并促进其活化

A：LPS 刺激 BMDMs 中 COX 酶活性检测；
B–C：293T 细胞转染 HA-RIPK1/Flag-COX2 或 Flag-RIPK1/HA-COX2 后，采用抗 Flag 磁珠进行免疫沉淀并进行免疫印迹分析；
D：全长 RIPK1 及其截短突变体示意图；
E：293T 细胞转染 Flag 标记 RIPK1 或其截短突变体以及 HA-COX2 后，进行 Co-IP 分析；
F：293T 细胞转染 Flag-RIPK1^WT 或 Flag-RIPK1^D138N 及 HA-COX2 后，检测二者相互作用；
G：2周龄小鼠皮肤组织裂解液中 RIPK1 和 RIPK3 相互作用的 Co-IP 和 Western blot 分析；
H：在有或无相关抑制剂条件下，检测不同基因型 BMDMs 经 LPS（100 ng/mL）刺激后的 PGE2 释放；
I：293T 细胞转染 Flag-RIPK3 或 Flag-MLKL 及 HA-COX2 后，检测其相互作用；
J：293T 细胞转染 Flag-RIPK3 或其突变体及 HA-COX2 后，进行 Co-IP 分析；
K：在有或无 RIPK3 抑制剂条件下，检测不同基因型 BMDMs 经 LPS 刺激后的 IL-1β 释放；
L：不同基因型 BMDMs 经 LPS 刺激9 h 后，检测 RIPK1、RIPK3 和 COX2 复合物形成；
M：DSS 交联实验检测 COX2 二聚体形成；
N：不同基因型 BMDMs 经 LPS 刺激16 h 后检测 IL-1β 释放；
O：LPS（40 mg/kg）攻击前3 h 给予 PBS 或塞来昔布（50 mg/kg）预处理的 Ripk1^K,D/K,D 小鼠生存曲线。
生存曲线比较采用 Log-Rank（Mantel–Cox）检验；A、H、K、N 图数据以均数 ± SEM 表示，采用双因素方差分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

6. RIPK3 而非 MLKL 介导 RIPK1^K376R 突变诱导的系统性炎症

在明确 RIPK1 可通过 RIPK3 促进支架依赖性 IL-1β 分泌后，研究者进一步评估 RIPK3 是否在体内系统性炎症中发挥关键作用。

在 Ripk1^K,D/K,D 小鼠中敲除 Ripk3，可显著减少皮肤和肝脏中的免疫细胞浸润，并缓解脾肿大和免疫紊乱。相反，敲除 Mlkl 并不能改善这些表型。同时敲除 Mlkl 和 Casp1/11 可恢复免疫浸润，说明 MLKL 非依赖性通路参与该炎症反应。

重要的是，Ripk3^−/− 而不是 Mlkl^−/− 可挽救 LPS 诱导的 Ripk1^K,D/K,D 小鼠早期死亡。上述结果表明，RIPK1 介导的系统性炎症依赖 RIPK3 驱动的炎症信号，而非 MLKL 依赖性坏死性凋亡。

尽管 Ripk3 敲除可大幅挽救 Ripk1^K,D/K,D 小鼠系统性炎症，但仍残留部分皮肤炎症和表皮增生。皮肤组织 Western blot 分析显示，Ripk1^K,D/K,D Ripk3^−/− 小鼠中仍存在凋亡信号。类似地，LPS 刺激的 Ripk1^K,D/K,D Ripk3^−/− BMDMs 中也可检测到凋亡。这提示除 RIPK3 介导的炎症外，凋亡也可能参与皮肤炎症。

鉴于 TNFR1 信号是 RIPK1 介导凋亡的主要通路，研究进一步分析其在 Ripk1^K,D/K,D 皮肤炎症中的作用。遗传性敲除 Tnfr1 可显著减少 Ripk1^K,D/K,D 小鼠皮肤和肝脏中的免疫细胞浸润，并抑制皮肤组织中的凋亡信号和炎症小体活化。此外，Tnfr1 敲除可部分改善 LPS 攻击 Ripk1^K,D/K,D 小鼠的生存率。

综上，RIPK1 支架依赖性系统性炎症由 RIPK3 依赖性炎症信号以及一条平行的 RIPK3 非依赖性、TNFR1 介导的凋亡机制共同驱动。

图6 RIPK3 而非 MLKL 负责 RIPK1 支架介导的系统性炎症

A：出生后第14天不同基因型小鼠皮肤切片的 H&E、IHC（CD45）和免疫荧光染色图像，其中 K6 为绿色、K10 为红色；
B：2周龄不同基因型小鼠皮肤表皮厚度、炎症面积和 CD45^+ 细胞数量统计；
C：8周龄不同基因型小鼠脾脏重量，以及脾脏中 CD3^+ T 细胞、B220^+ B 细胞和 Gr-1^+CD11B^+ 细胞数量；
D：LPS（50 mg/kg）攻击后不同基因型小鼠生存曲线；
E：Western blot 检测不同基因型 P14 小鼠皮肤组织蛋白表达；
F：LPS 刺激18 h 后 BMDMs 蛋白表达的 Western blot 分析；
G：Western blot 检测不同基因型 P14 小鼠皮肤组织蛋白表达。
D 图生存曲线比较采用 Log-Rank（Mantel–Cox）检验；B、C 图数据以均数 ± SEM 表示，采用双因素方差分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

【Citation】:Li M, Liu J, Xing M, Liu H, Wang L, Wu X, Ou Y, Zhao X, Wang Y, Xie Y, Zhang H, Wu Z, Hao J, Li H, Li Y, Zhang H. RIPK1 ubiquitination regulates its kinase-independent function in development and inflammation.Proc Natl Acad Sci U S A.2026Apr 14;123(15):e2520356123.

【贡献】★★★★★

本研究揭示了 RIPK1 泛素化在调控其发育和炎症功能中的双重作用。

首先，RIPK1 K376 位点泛素化缺失会导致 RIPK1 激酶过度活化，进而诱导凋亡和坏死性凋亡，造成胚胎期致死。通过在 K376R 背景下引入 D138N 激酶失活突变，可完全挽救这一胚胎致死表型，说明 RIPK1 K376R 介导的胚胎死亡主要依赖 RIPK1 激酶活性。

其次，尽管激酶失活可避免胚胎死亡，Ripk1^K376R,D138N/K376R,D138N 小鼠出生后仍出现系统性炎症，尤其表现于皮肤和肝脏。该炎症并非由 RIPK1 激酶活性驱动，而是依赖 RIPK1 的支架功能，并需要两个拷贝的 RIPK1 支架蛋白参与。

机制上，RIPK1 K376R 突变可通过激酶非依赖性方式触发内源性 NLRP3 炎症小体活化，促进 Caspase-1/11 介导的 IL-1β 分泌。该过程与 ROS 增加、线粒体功能异常和花生四烯酸代谢重编程密切相关。

进一步研究表明，RIPK1 可通过 RIPK3 依赖性但 MLKL 非依赖性的方式调控 COX2 活化，促进 PGE2 生成，进而推动 IL-1β 释放和系统性炎症。该通路不依赖 RIPK3 激酶活性，而依赖 RIPK1-RIPK3-COX2 复合物形成和 RIPK3 的 RHIM 结构域。

此外，TNFR1 介导的 RIPK3 非依赖性凋亡通路也参与残余炎症反应。因此，RIPK1 支架驱动的系统性炎症主要由两条路径共同决定：一是 RIPK1/RIPK3-COX2-PGE2-NLRP3-IL-1β 炎症轴，二是 TNFR1 介导的凋亡相关炎症通路。

整体而言，本研究提出了 RIPK1 功能分叉的新模型：
RIPK1 激酶活性主要控制发育阶段的细胞死亡，而 RIPK1 支架功能则在成年阶段通过代谢重编程和炎症小体活化驱动系统性炎症。

这一发现加深了对 RIPK1 在先天免疫、炎症性疾病和细胞死亡调控中作用的理解，也为开发选择性靶向 RIPK1 支架功能、同时保留其发育必需作用的新一代治疗策略提供了理论基础。

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