四川大学张兴栋院士团队ACS Nano：开发出新型仿生涂层，为心脏封堵器植入带来组织愈合新希望

先天性心脏病是最常见的新生儿出生缺陷，全球发病率约为0.6-1.2%，其中约60%的病例需要干预治疗。目前，微创经导管封堵器植入术已成为治疗房间隔缺损、室间隔缺损等先天性心脏缺陷的主要手段。然而，临床实践中封堵器植入仍面临着重大的挑战：材料相对不足的生物相容性往往导致凝血、持续性炎症、内皮化不完全以及组织愈合延迟，这些情况常引发长期临床并发症，如器械相关血栓、封堵器移位或脱落、局部残余血液分流以及广泛纤维组织增生。因此，如何优化封堵器性能，实现快速再内皮化和原位组织愈合，成为当前研究的迫切需求。

针对这一临床难题，四川大学张兴栋院士、杨立副研究员团队提出了一种基于细胞外基质仿生理念的微环境调控涂层。该研究通过使用具有抗污作用的聚乙二醇连接链，利用高效的点击化学反应，将具有高细胞粘附活性的定制重组人源化I型胶原蛋白接枝到材料表面。体外血液和细胞实验证实，该涂层不仅改善了血液相容性，促进内皮细胞生长，还能增强心肌细胞功能。皮下和血管内植入实验进一步验证了该涂层通过诱导炎症细胞向抗炎表型极化来减轻炎症反应，加速内皮化进程，并促进组织修复。这一研究成果为优化心脏封堵器性能、提升临床疗效提供了极具前景的新策略。相关论文以“Tailored Extracellular Matrix-Biomimetic Coating Favors Tissue Healing by Modulating the Microenvironment”为题，发表在

ACS Nano

研究团队首先对定制的重组人源化I型胶原蛋白进行了系统的结构表征和生物相容性评估。结果显示，rhCol I形成了稳定的三螺旋结构，具有与天然I型胶原相似的高级结构。细胞活力实验表明，与人脐静脉内皮细胞和大鼠心肌细胞共培养后，rhCol I在促进细胞粘附和增殖方面显著优于多种动物来源的胶原蛋白。免疫原性结果也证实，rhCol I引发的免疫反应最轻微，与阴性对照组无显著差异，展现了其在植入器械表面改性中的巨大应用潜力和优势。

图1. 定制的ECM仿生微环境调控涂层的（A）制备过程和（B）功能模型示意图。 首先，裸材料经过等离子体处理后在其表面获得活性羟基。随后，通过炔基-PEG-硅烷末端的三乙氧基硅烷基团与羟基的缩合反应，将炔基-PEG-硅烷链固定在基底表面，制备APS涂层。最后，通过其氨基与炔基-PEG-硅烷链另一端的炔基之间的共价点击反应，将定制的rhCol I引入系统，制备APS/rhCol I涂层。涂层中的PEG长链能快速吸水形成稳定的水化层，发挥抗污功能，防止血液成分粘附，从而实现抗凝和抗炎效果。rhCol I丰富的GER和GEK基序可与细胞膜表面的整合素结合，模拟ECM并促进细胞粘附，从而加速内皮化。

基于这一优异的生物材料，研究人员通过两步法制备了APS/rhCol I涂层。扫描电镜和原子力显微镜图像显示，在经过等离子处理的基础材料表面，APS涂层形成了均匀连续的薄膜，粗糙度为17.00±1.29纳米，厚度为21.40±0.80纳米。当进一步引入rhCol I后，APS/rhCol I涂层表面变得更加致密，粗糙度和厚度分别增加至21.13±1.30纳米和25.67±1.01纳米。衰减全反射傅里叶变换红外光谱和X射线光电子能谱分析证实了涂层的成功构建：APS/rhCol I涂层在1645 cm⁻¹和1544 cm⁻¹处出现了归属于rhCol I肽键中C=O伸缩振动和N-H弯曲振动的新峰，且氮元素比例显著增加。水接触角测试表明，APS涂层因PEG分子富含醚键和羟基，显著提升了基底亲水性。动态水接触角结果直接证实了涂层中PEG链的快速水合作用，能够在固-液界面形成膨胀的动态富水水合层。石英晶体微天平耗散监测实验中，APS涂层上显著的频率下降和耗散上升，是PEG链吸附并键合大量水分子形成柔软粘弹性水合层的直接证据。APS/rhCol I涂层则表现出更明显的频率下降和耗散上升，这归因于rhCol I本身作为柔软的、可结合大量水的多孔蛋白网络，与PEG水合作用协同，形成了更厚、更具粘弹性的复合水合层。在长达60天的模拟生理流体动态冲刷实验中，APS/rhCol I涂层展现出良好的结构完整性和功能组分稳定性。荧光图像显示，即使经过60天冲洗，涂层表面仍能保留初始荧光强度的40.03±4.25%，BCA定量检测也证实rhCol I的保留率仍达42.75%，为其长期稳定性提供了初步证据。

图2. 涂层的表征。 （A）裸PDO、APS和APS/rhCol I涂层的SEM和（B）AFM图像。不同样品的（C）表面粗糙度和（D）涂层厚度。不同样品的（E）ATR-FTIR光谱、（F）XPS宽扫光谱和（G-I）XPS C 1s高分辨窄谱。（J）不同时间点样品的水接触角。通过QCM-D监测的裸、APS和APS/rhCol I涂层镀金石英晶体的实时（K）频率和（L）耗散变化。（M）基于蠕动泵的循环系统示意图。（N）FITC标记的APS/rhCol I涂层在PBS冲洗0、7、15、30和60天后的荧光图像。（O）APS/rhCol I涂层在PBS冲洗0、7、15、30和60天后的荧光强度和rhCol I密度的定量统计。

在血液相容性评价中，静态血小板粘附结果显示，APS和APS/rhCol I涂层表面仅粘附少量未活化球形血小板，而未经修饰的PDO表面则粘附大量伸出伪足、呈铺展形态的活化血小板。血小板形态统计和乳酸脱氢酶定量结果进一步证实了涂层优异的抗血细胞粘附能力。P-选择素免疫荧光染色显示，APS/rhCol I组血小板表面P-选择素表达水平显著低于PDO组，表明涂层有效抑制了血小板活化。即使经过30天冲洗，APS/rhCol I涂层仍保持着显著的抗血小板粘附和活化能力。新西兰大白兔的体外血液循环实验直观显示，经过2小时循环后，未经修饰的PDO表面沉积了大量血栓，管腔闭塞率达44.41±5.35%，血栓重量达21.89±3.59毫克；而APS和APS/rhCol I涂层组几乎未见管腔闭塞和可见血栓。扫描电镜图像进一步证实，未修饰的PDO表面被纤维蛋白、血小板和红细胞聚集形成的血栓覆盖，而涂层表面仅粘附少量稀疏血小板。所有样品的溶血率均低于1%，远低于5%的安全标准，表明涂层无溶血风险。

图3. 涂层的血液相容性评价。 （A）血小板在裸、APS和APS/rhCol I涂层PDO基底上粘附的SEM图像和（B）计数。（C）基于活化程度的血小板形态分类和统计。（D）LDH定量分析和（E）不同样品表面的全血粘附SEM图像。（F）粘附于不同样品表面的血小板P-选择素表达的定量统计和（G）免疫荧光图像。（H）兔离体血液循环动静脉分流模型示意图。（I）循环2小时后不同组导管横截面和样品表面的照片。不同组（J）管腔闭塞率和（K）血栓重量的统计。（L）离体循环2小时后不同样品表面的SEM图像。（M）不同样品的溶血率统计。

为评估涂层促进体内再内皮化的潜力，研究人员系统研究了APS/rhCol I涂层对人脐静脉内皮细胞生长行为的影响。活/死细胞染色和CCK-8分析显示，所有样品表面细胞均存活良好，无细胞毒性。与PDO组相比，APS表面因PEG抗污作用，内皮细胞粘附和增殖有所下降；而APS/rhCol I表面引入富含高细胞粘附片段（GER和GEK）的rhCol I后，内皮细胞生长活性显著增强。细胞骨架染色和划痕实验表明，APS/rhCol I表面的内皮细胞铺展形态更佳，迁移活性也得到显著促进。体外管形成实验显示，APS/rhCol I组形成了更多的管状结构， junctions数量和总管长均显著增加，表明该涂层具有促进血管生成的潜力。RNA测序分析显示，与PDO组相比，APS/rhCol I组有212个基因上调，358个基因下调。KEGG通路富集分析表明，上调通路主要与细胞粘附和增殖相关，而下调通路多与炎症相关。基因集富集分析和Western blot结果证实，APS/rhCol I涂层通过与细胞膜整合素结合，激活PI3K-Akt信号通路，从而促进细胞生长，为其促内皮化功能提供了直接的分子机制证据。

图4. HUVEC生长行为评价。 （A）在裸、APS和APS/rhCol I涂层PDO基底上培养1天和3天后HUVEC的活死染色图像和（B）细胞活力。（C）FDA染色图像和（D）在不同样品表面迁移1天和2天的HUVEC迁移率统计。（E）FDA染色图像、（F）连接点数量和（G）用PDO、APS和APS/rhCol I提取物处理8小时后Matrigel上HUVEC管形成的总管长度。HUVEC的RNA测序分析。（H）在裸PDO和APS/rhCol I涂层上培养的HUVEC中，差异表达基因的火山图。PDO组与APS/rhCol I组中（I）上调基因和（J）下调基因的KEGG通路富集分析气泡图。PDO组与APS/rhCol I组中（K）上调基因和（L）下调基因的KEGG通路富集分析弦图。与PDO组相比，在APS/rhCol I涂层组中获得的与（M）细胞粘附和增殖、（N）细胞迁移、（O）血管生成和（P）炎症调节相关的差异表达基因热图。GO通路富集分析。PDO组与APS/rhCol I组中（Q）运动蛋白、（R）细胞粘附和（S）细胞迁移的GSEA图。（T）基于STRING数据库的基因相互作用网络。（U）在裸PDO和APS/rhCol I涂层上培养3天的HUVEC中PI3K、Akt和p-Akt表达的Western blot分析，以及（V）相应的定量统计。（W）APS/rhCol I涂层促进细胞生长的示意图。

考虑到器械植入心脏环境后对心肌细胞安全性和功能性的影响，研究团队评估了APS/rhCol I涂层对大鼠心肌细胞H9c2的细胞相容性。细胞骨架染色和CCK-8结果显示，APS涂层因PEG的抗污作用降低了H9c2细胞的粘附和增殖；而引入rhCol I后，这些细胞行为得到显著改善。更重要的是，APS/rhCol I表面的H9c2细胞呈现更长的长径比、更大的细胞面积和更有序的纤维排列，这对心肌细胞的收缩功能至关重要。RNA测序分析显示，APS/rhCol I涂层组有284个基因上调和109个基因下调。KEGG和GO通路富集分析表明，差异表达基因显著富集于与心脏兴奋-收缩耦联和收缩力调节直接相关的通路，如钙信号通路、多巴胺能突触等。Western blot验证结果显示，与PDO组相比，APS/rhCol I组H9c2细胞中连接蛋白43、心肌肌钙蛋白T和α-辅肌动蛋白的表达水平显著升高，从蛋白质水平证实了涂层增强心肌细胞收缩功能的积极作用。

图5. H9c2细胞生长行为评价。 （A）在裸、APS和APS/rhCol I涂层PDO基底上培养1天和3天后H9c2细胞的细胞骨架染色图像，以及（B）细胞活力、（C）细胞长径比和（D）细胞面积的定量统计。H9c2细胞的RNA测序分析。（E）主成分分析图。（F）在裸PDO和APS/rhCol I涂层上培养的H9c2细胞中，差异表达基因的火山图。（G）PDO组与APS/rhCol I组的KEGG通路富集分析气泡图。（H）PDO组与APS/rhCol I组的GO通路富集分析条形图。（I）PDO组与APS/rhCol I组中与心肌收缩相关的KEGG通路富集分析弦图。（J）在KEGG通路富集分析中，与PDO组相比，APS/rhCol I涂层组中与心肌收缩相关的差异表达基因热图。（K）在裸PDO和APS/rhCol I涂层上培养3天的H9c2细胞中Cx43、cTnT和α-actinin表达的Western blot分析，以及（L）相应的定量统计。

为评估涂层的炎症反应，研究团队研究了小鼠巨噬细胞RAW264.7的生长行为。细胞骨架染色和CCK-8结果显示，PDO表面粘附大量呈伸长拉伸形态的活化巨噬细胞；APS表面因PEG分子抗污作用，巨噬细胞粘附显著减少；APS/rhCol I表面巨噬细胞粘附虽略高于APS组，但仍远低于PDO组，且细胞呈静息球形。ELISA检测显示，APS/rhCol I组细胞表达更多的抗炎细胞因子TGF-β1，更少的促炎细胞因子TNF-α。流式细胞术分析表明，与PDO组相比，APS/rhCol I涂层显著降低了M1型标志物CD86+细胞比例，同时显著提高了M2型标志物CD206+细胞比例。RNA测序分析显示，APS/rhCol I组有148个基因下调，276个基因上调。KEGG通路富集分析表明，差异表达基因显著富集于IL-17信号通路、JAK-STAT信号通路等多个炎症相关通路。qRT-PCR验证结果显示，M1型相关基因mRNA表达下降，M2型相关基因表达显著上升。这些结果证实，APS/rhCol I涂层能有效诱导巨噬细胞向抗炎的M2表型极化，抑制炎症反应。

图6. 炎症反应评价。 （A）在裸、APS和APS/rhCol I涂层PDO基底上培养2天后RAW264.7细胞的细胞骨架染色图像和（B）细胞活力。通过ELISA试剂盒测定RAW264.7细胞中（C）TNF-α和（D）TGF-β1的表达。（E）在裸、APS和APS/rhCol I涂层PDO基底上培养2天后，RAW264.7细胞中CD206和CD86的流式细胞术分析图像和（F）定量统计。RAW264.7细胞的RNA测序分析。（G）在裸PDO和APS/rhCol I涂层上培养的RAW264.7细胞中，差异表达基因的火山图。（H）PDO组与APS/rhCol I组的KEGG通路富集分析桑基气泡图。（I）PDO组与APS/rhCol I组的GO通路富集分析条形图。（J）桑基气泡图中差异表达基因的热图。（K）通过qRT-PCR定量分析PDO组与APS/rhCol I组中代表性基因的表达。

在大鼠皮下植入模型中，组织学评估显示，植入15天和30天后，PDO、APS和APS/rhCol I样品周围纤维囊厚度依次减小。免疫荧光分析表明，在整个植入期间，APS/rhCol I组比PDO组表达更多的抗炎因子IL-10，更少的促炎因子TNF-α，与体外巨噬细胞实验结果一致。血管生成评估显示，植入15天时，APS/rhCol I组CD31和α-SMA的表达水平已显著高于PDO和APS组；30天时，这种差异进一步扩大，且APS/rhCol I组新生血管密度较15天显著增加，表明该涂层能持续、积极地促进血管生成。

图7. 皮下植入模型中的组织相容性和血管生成评价。 （A）大鼠皮下植入模型示意图。植入15天和30天后，包裹裸、APS和APS/rhCol I涂层PDO单丝的纤维囊的（B）苏木精和伊红染色图像和（C）厚度统计。这些纤维囊中（D）IL-10和TNF-α表达的免疫荧光染色图像和（E、F）定量统计。（G）这些纤维囊中CD31和α-SMA表达的免疫荧光染色图像和（H、I）定量统计。

在兔颈动脉血管内植入模型中，研究人员通过免疫荧光染色评估了涂层表面CD31和eNOS的表达。植入20天后，PDO表面仅见稀疏分布的CD31和eNOS信号，而APS/rhCol I表面信号显著增加；40天时，PDO组信号有所上升，但APS/rhCol I组信号已高达94.90±6.29%和93.24±5.69%；80天时，PDO组仍存在不连续、异质性的荧光信号，而APS/rhCol I组实现了100%的完全内皮覆盖，CD31和eNOS信号连续、致密、均匀分布，形态上类似于邻近的天然血管内皮。H&E染色和CD68免疫组化分析显示，植入20天和40天时，APS/rhCol I组新生内膜面积显著小于PDO组，CD68密度也远低于PDO组。80天时，PDO组持续呈现慢性炎症反应，新生内膜增生随时间推移显著进展；而APS/rhCol I组始终保持低水平的CD68信号，有效抑制了病理性新生内膜增生，展现出优异的长期组织相容性。

图8. 血管内植入模型中的再内皮化和组织愈合评价。 （A）兔颈动脉中PDO单丝植入模型示意图。植入20、40和80天后，裸和APS/rhCol I涂层PDO单丝表面上（B）CD31和eNOS表达的免疫荧光染色图像和（C、D）定量统计。植入20、40和80天后，含有单丝的血管横截面的（E）H&E染色图像和（F）新生内膜面积定量统计。这些横截面中（G）CD68表达的免疫组织化学染色图像和（H）定量统计。（I）这些血管横截面中CD31表达的免疫荧光染色图像。（J）内皮细胞覆盖率的定量统计。

综上所述，这项研究通过点击化学反应，将功能化的炔基-PEG-硅烷链与定制的重组人源化I型胶原蛋白结合，成功开发出一种用于心脏封堵器的细胞外基质仿生微环境调控涂层。该涂层中的炔基-PEG-硅烷链通过形成水合层发挥抗污作用，表现出优异的抗血栓形成和抗炎细胞浸润能力；富含高细胞粘附片段的rhCol I则通过与细胞膜整合素结合，促进内皮细胞增殖、迁移和血管生成，并通过调控多种信号通路改善心肌细胞功能。皮下和血管内植入实验证实，APS/rhCol I涂层通过调控炎性细胞极化抑制炎症，促进再内皮化和组织愈合。这种定制化的细胞外基质仿生涂层为封堵器植入后营造了有利的微环境，在提高封堵器临床疗效方面展现出巨大潜力。未来，研究团队将致力于将这项涂层技术转化到全尺寸封堵器上，在心脏缺损大动物模型中评估其长期性能，并探索其在其他类型植入式医疗器械中的应用前景。