抗体偶联药物（ADC）的制剂开发深度解析

抗体药物偶联物作为肿瘤靶向治疗的重要突破，其复杂的分子结构对制剂开发提出了前所未有的挑战。 成功的ADC制剂不仅是“稳定的配方”，更是对分子脆弱性的深刻理解和精准调控，确保这颗“生物导弹”在命中靶点前保持完好，在命中后精确引爆。

今天为大家解读一篇关于ADC药物制剂研究 相关的文章。 涵盖连接子稳定性机制、药物负载分布表征、聚集行为解析以及制剂策略（pH、缓冲剂、抗氧化剂和表面活性剂等制剂参数）研究，以期为大家在ADC药物制剂研究方面提供 参考。

一、硫代琥珀酰亚胺连接子稳定性：分子机制与调控策略

目前上市ADC大多含有一个共同部分：硫代琥珀酰亚胺连接子，该连接子易发生琥珀酰亚胺水解和硫醚键断裂。

1.1 降解途径的分子机理

研究表明，ADC中常见的硫代琥珀酰亚胺连接子主要通过两条相互竞争的途径降解：

途径一：琥珀酰亚胺水解

该反应在生理条件下持续进行，形成带负电荷的开环结构。水解速率遵循碱催化机制，对氢氧根离子浓度高度敏感，在pH > 6.0时显著加速。

途径二：逆迈克尔交换反应

在含巯基化合物（如血浆白蛋白Cys34、谷胱甘肽）存在下，硫代琥珀酰亚胺连接子发生可逆的硫醚键断裂，形成白蛋白-药物偶联物，导致靶向性丧失。

图1. 模型化合物S-(N-乙基琥珀酰亚胺基)-N-乙酰-L-半胱氨酸（NEM -NACys）的降解途径：(i)琥珀酰亚胺水解；(ii)在Michael供体（GSH 谷胱甘肽）存在下发生的逆向Michael反应

1.2 位点特异性工程对稳定性的影响

THIOMAB®技术通过定点引入工程化半胱氨酸，实现药物均一偶联。研究发现，不同偶联位点的微环境显著影响降解行为：

轻链偶联变体（Lc-TDC）

• 局部正电荷环境提高氢氧根离子浓度；

• 琥珀酰亚胺水解速率比Fc变体快3-5倍；

• 快速水解形成稳定的开环结构，抑制逆迈克尔反应。

Fc区偶联变体（Fc-TDC）

• 高溶剂可及性促进与血浆蛋白接触；

• 白蛋白加合物形成增加2-3倍；

• 体内清除加快，药效降低。

连接子稳定性是ADC的关键质量属性之一。对于硫代琥珀酰亚胺连接子，琥珀酰亚胺水解会从开环形式产生额外电荷，改变其电荷状态和疏水性。rpHPLC-MS可用于分析血清中完整ADC的硫代琥珀酰亚胺连接子水解。利用新型蛋白水解酶的独特特异性，该酶在铰链区切割，仅需几分钟即可在温和的生理pH条件下产生纯F(ab′)2片段和Fc，且不发生进一步降解。另一种方法是成像毛细管等电聚焦（iCIEF），蛋白质电荷变体高分辨率分离方法。为了准确测定iCIEF中硫代琥珀酰亚胺连接子的琥珀酰亚胺水解水平，必须扣除ADC抗体部分脱酰胺的贡献。图2显示了半胱氨酸连接ADC与其未结合单克隆抗体前体的 ICIEF 曲线叠加图。酸性区域iCIEF曲线的异质性是由于ADC从连接子的脱酰胺和琥珀酰亚胺水解中获得的各种负电荷所致。基于以下假设：(i)电荷变异仅由脱酰胺作用和硫代琥珀酰亚胺连接体水解引起；(ii)主峰向酸性区域的每个峰移代表一个电荷的增加。

图2. (a) 未结合单克隆抗体溶液在pH 9条件下孵育48小时的 ICIEF 谱：由脱酰胺作用产生的带负电荷变体；(b) 半胱氨酸连接抗体药物偶联物在pH 9条件下孵育8、16、24和48小时的 ICIEF 谱：由脱酰胺作用和琥珀酰亚胺水解共同产生的带负电荷变体。

新一代ADC连接子在马来酰亚胺邻位引入碱性氨基，实现分子内碱催化，在pH 7.4、25°C条件下2小时内完成琥珀酰亚胺开环，从源头上消除逆迈克尔反应风险。

二、DAR表征技术：从平均测定到分布解析 2.1 多元分析方法体系

2.2 创新方法：酶切与-RP-HPLC联用

利用特异性IgG水解酶在铰链区切割，温和条件下5分钟内生成F(ab')2和Fc片段，结合质谱检测，实现：

• 位点特异性琥珀酰亚胺水解监测；

• 开环与闭环形式定量分析；

• 保持天然构象完整性。

更多DAR值检测方法可阅读以下往期文章：

三、DAR值对ADC稳定性的系统性影响

无论是半胱氨酸连接还是赖氨酸连接的ADC，其药物分子与抗体的分布往往呈现异质性。由于疏水性细胞毒性药物的附着改变了抗体表面特性，或药物负载诱导的分子间/分子内相互作用改变了抗体的高阶结构导致ADC相较于未结合的单克隆抗体更易发生聚集。例如，对于平均DAR为3.5的半胱氨酸连接ADC，在热应激条件下，其DAR 6和DAR 8等高DAR组分是形成高分子量物质（HMWS）的主要原因。这些高DAR组分ADC不可逆、非共价且结构改变的形式。基于差示扫描量热法（DSC），可以推断ADC分子铰链区/甲烯结构域在热应力下会发生不稳定化（图3）。随着抗体平均DAR值的增加，甲烯结构域的熔解温度起始点降低，导致多次甲烯熔解转变。

3.1 聚集行为的DAR依赖性

热力学失稳机制：

通过差示扫描量热法（DSC）研究发现，ADC的CH2结构域熔化温度（Tm）随DAR增加而线性下降，平均DAR从0升至6时，Tm降低约8-10°C。这种结构柔性的增加源于：

1. 疏水相互作用改变：细胞毒素的疏水性破坏表面水化层；

2. 电荷分布扰动：连接子引入额外电荷改变静电相互作用；

3. 空间位阻效应：高DAR阻碍分子内稳定相互作用。

图3. 裸抗及平均DAR值分别为2、3.5和6的ADC的DSC图

3.2 离子强度的协同效应

离子强度也可能影响抗体药物偶联物（ADC）的稳定性，使其比非偶联抗体更易发生聚集。随着离子强度的增加，形成了大量聚集体，而单克隆抗体在高达500 mM氯化钠溶液中的热稳定性未受影响。DAR对ADC物理稳定性的影响会随着溶液离子强度的增加而加剧。通过差示扫描量热法显示，热诱导解折叠与药物载量之间的相关性表明，相同DAR物种在高离子强度溶液（20 mM乙酸组氨酸，pH 5.5,100 mM氯化钠）中的熔点显著低于低离子强度溶液（20 mM乙酸组氨酸，pH 5.5）（图4）。其他形式的应激（如搅拌、光照、氧化应激或静脉给药时稀释至生理盐水，如DS8201 用5%的葡萄糖稀释，不可使用0.9%氯化钠稀释）也可能诱导聚集，这与大多数单克隆抗体对这些应激的反应方式相似。

在20 mM组氨酸醋酸盐缓冲液（pH 5.5）体系中，添加100 mM NaCl导致：

• 同一DAR物种的Tm进一步降低3-5°C；

• 高DAR物种（≥6）聚集速率增加5-10倍；

• 不可逆聚集体比例显著升高。

  
  

  图4. 离子强度对半胱氨酸连接ADC在低离子强度溶液（20 mM乙酸组氨酸pH 5.5）和高离子强度溶液（20 mM乙酸组氨酸pH 5.5,100 mM氯化钠）中热稳定性的影响

THIOMAB®-药物偶联物主要产生DAR 2的均一产物，与传统的DAR 0-8混合物相比：

• 聚集倾向降低60-80%；

• 药代动力学一致性提高；

• 剂量-效应关系更可预测。

更多ADC稳定性内容可阅读以下往期文章：

四、ADC制剂开发的关键参数优化 4.1 pH与缓冲体系的精细调控

与单克隆抗体的脱酰胺、片段化、异构化等控制降解途径类似，配方pH和缓冲液的选择在控制ADCs的硫代琥珀酰亚胺醚连接体的琥珀酰亚胺水解速率中起着关键作用。

pH选择策略：

基于四肽模型（Ac-Gly-X-Gly-NHMe）的pH-速率图谱(图5)分析显示：

• 琥珀酰亚胺水解：pH 5-7范围内速率增加100倍；

• 天冬酰胺脱酰胺：pH > 6时急剧加速；

• 天冬氨酸异构化：pH 3-6范围内依赖羧基质子化状态。

建议：采用pH 5.0-5.5弱酸性条件，平衡水解抑制与结构稳定性。

缓冲剂选择考量：

• 乙酸盐缓冲液：加速条件下降解较快，但长期储存稳定性良好；

• 组氨酸缓冲液：广泛用于抗体制剂，但需关注氧化降解风险；

• 温度效应：缓冲体系pKa温度系数影响实际pH，需在2-8°C和25°C下全面评估。

图5. pH–速率曲线图：四肽（Ac-Gly-x-Gly-NHMe）：x = 天冬酰胺（Asn）或天冬氨酸（Asp）或琥珀酰亚胺（Asu）。（数据重构自参考文献）

4.2 抗氧化保护的多层防御体系

氧化风险点：

1. 抗体部分：Met、Trp、His等敏感残基；

2. 连接子：马来酰亚胺可能的光敏性；

3. 细胞毒素：某些毒素具有氧化敏感基团。

抗氧化策略矩阵：

4.3 表面活性剂的理性使用

由于抗体药物偶联物（ADC）与抗体相比更易发生聚集，这源于其药物-抗体反应（DAR）分布的异质性和细胞毒性药物固有的疏水性，因此ADC制剂可能需要更高比例的聚山梨酯。

聚山梨酯的功能与局限：

• 有效浓度：0.01-0.1% (w/v) 防止界面吸附。对于静脉注射给药，需综合评估注射液体积、材料、静脉输液袋顶空、稀释剂及稀释倍数、给药强度、给药持续时间以及稀释后运输模拟等参数，以确定制剂中适宜的聚山梨酯含量。

• 氧化风险：存储过程中生成过氧化物（可达100-500 ppm）。在光照、温度升高或储存催化剂等压力下，可形成大量过氧化物，导致PS和蛋白质氧化。

• 酶促降解：脂肪酶样酶在抗体原液中催化酯键水解。

• 降解产物：脂肪酸、聚乙二醇片段，降解产物可引发聚集现象可能引发颗粒形成。

替代表面活性剂探索：

• 泊洛沙姆系列（188、407）

• 聚乙二醇-磷脂衍生物

• 氨基酸型表面活性剂

优势维度：

• 生产工艺简单，成本可控；

• 给药便捷，无需复溶步骤；

• 适合高浓度、大体积给药。

稳定性挑战：

1. 化学降解：连接子水解、药物释放速率可达0.5-2%/月；

2. 物理失稳：聚集、颗粒形成加速；

3. 使用过程风险：稀释、输液泵剪切、光照暴露。

关键质量属性矩阵：

比表面积的调控价值：

BET分析揭示，冻干饼的比表面积（通常为0.5-5 m²/g）与蛋白表面暴露程度直接相关。低比表面积（< 1 m²/g）产品在长期储存中表现出：

• 氧化速率降低40-60%；

• 聚集程度减少50-70%；

• 一致性更好的复溶行为。

工艺优化方向：

• 退火步骤降低比表面积；

• 甘露醇-蔗糖组合构建稳定基质；

• 冻干循环参数对多孔结构的精细调控。

无论是液态还是冻干制剂，都必须在产品开发的早期和后期阶段明确其化学特性及主要降解产物水平。为此，需设计适当的临床前及临床研究以评估产品相关降解物和杂质的潜在影响。

由于抗体药物偶联物（ADC）的复杂性，制剂开发不仅需要理解单克隆抗体的理化稳定性，还需考虑小分子细胞毒性药物、连接子部分以及ADC自身固有的不稳定性。

除ADC高聚集倾向外，影响疗效、安全性和稳定性的主要问题之一是ADC产品中游离药物水平过高，这可能引发显著不良反应。尽管液体制剂在药物生产及给药便利性方面具有优势，但由于水溶液中产品稳定性问题，尽管生产工艺复杂，冻干制剂仍常被选用，这一点在包括布伦妥昔单抗维多汀和曲妥珠单抗艾美替尼在内的众多临床及商业产品中得到证实。然而，冻干并非解决所有稳定性问题的万能药。虽然通常认为低水分含量可提高稳定性，但也有研究探讨了表面积对蛋白质物理和化学稳定性的影响。表面暴露的蛋白质更易受损，且稳定性提升似乎与表面积减少相关，尤其在蛋白质含量较低的冻干产品中。在某些情况下，具有相同残留水分含量的产品可能因表面积差异而在储存期间表现出显著不同的稳定性行为。除了稳定性测试、制剂开发和冻干工艺优化过程中常规评估的可溶性聚集体、可见及不可见颗粒、水分含量、冻干块外观、复溶时间及游离药物等关键质量属性外，基于氮气多层吸附与相对压力关系的布鲁纳-埃梅特-泰勒（BET）分析法测定冻干产物比表面积，可作为表征分析的补充手段。这些研究对于开发稳健的冻干工艺流程、确保冻干制剂成功具有关键作用。

六、结语：迈向下一代ADC制剂平台

ADC制剂开发已从经验驱动转向机理驱动的理性设计。未来发展方向包括：

1. 连接子化学创新：开发对水解和逆迈克尔反应均不敏感的新一代连接子；

2. 分析技术升级：原位、实时监控DAR分布与降解行为；

3. 制剂平台优化：基于AI的处方筛选与冻干工艺设计；

4. 给药系统整合：ADC与新型递送系统（如脂质体、纳米粒）结合。

随着对ADC分子行为理解的深入，制剂科学将在提升产品疗效、安全性和可开发性方面发挥愈加关键的作用。ADC制剂将继续向更稳定、更便捷、更智能的方向演进。

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