AT 647琥珀酰亚胺酯，ATTO 647 NHS ester，ATTO647 SE的正交反应

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产品名称：AT 647琥珀酰亚胺酯 ATTO 647 NHS ester，ATTO647 SE，AT647 NHS的生物正交反应
一、生物正交反应适配场景
1. 蛋白质/抗体标记
传统标记：通过NHS酯与蛋白质赖氨酸残基的伯胺反应，实现荧光标记，用于Western blot、ELISA、免疫荧光等实验。
生物正交标记：结合TCO修饰的抗体或配体，通过四嗪-TCO反应实现特异性标记，适用于活细胞表面受体追踪、靶向药物递送等。
2. 核酸标记与探针开发
寡核苷酸标记：NHS酯可与氨基修饰的DNA/RNA探针偶联，用于荧光原位杂交（FISH）、基因表达监测。
生物正交探针：结合叠氮化物或炔烃修饰的核酸探针，通过点击化学（如CuAAC或SPAAC）实现多色标记与信号放大。
3. 活细胞与体内成像
活细胞成像：四嗪-TCO反应可在活细胞中实现快速、无毒标记，用于细胞器动态追踪、信号通路研究。
活体成像：近红外荧光（发射波长669nm）具有深层组织穿透能力，结合生物正交反应可实现肿瘤靶向成像、药物分布监测。
4. 多色与超分辨成像
多色标记：与AF488（绿色）、AF647（红色）等染料联用，通过荧光补偿减少光谱重叠，实现共定位分析与多靶标检测。
超分辨显微镜：ATTO 647的高光稳定性支持STED、SIM等超分辨技术，用于纳米级结构解析。
二、优势与局限性
优势
荧光特性：近红外发射（669nm），低背景干扰，高量子产率（>0.6），适合深层组织成像。
生物相容性：NHS酯反应条件温和，四嗪-TCO反应无需金属催化剂，减少细胞毒性。
多功能集成：可结合传统标记与生物正交反应，实现复杂实验设计（如多色标记、信号放大）。
局限性
储存与稳定性：NHS酯易水解，需-20℃避光保存；四嗪基团需避免高温/强光，防止降解。
反应条件限制：四嗪-TCO反应需严格控制pH与温度，避免副反应；NHS酯反应需避免还原剂（如DTT）干扰。
成本与可及性：合成工艺复杂，成本较高，可能限制大规模应用。
三、操作与优化策略
反应条件优化
NHS酯标记：pH 7.0-9.0，室温孵育1-2小时，染料:蛋白质摩尔比1:5至1:20，避免高浓度导致聚集。
四嗪-TCO反应：pH 7-8，37℃孵育，TCO浓度需优化以平衡反应速度与特异性。
纯化与后处理
游离染料去除：凝胶过滤（PD-10柱）、透析（MWCO 3.5 kDa）或离心柱纯化，降低背景信号。
稳定性验证：通过SDS-PAGE、荧光分光光度计验证标记效率与荧光强度。

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