抗体亲和力/亲合力概念、改造策略、不同检测方法特点及与PK/PD的关系

单抗源于体液免疫的生物学机制，已成为诊断和治疗多种疾病的多样化、快速增长的疗法。2022年超250种抗体进入临床研究，2024年全球销售额前10的药物中至少一半为抗体。抗体药物研发的一个核心挑战是，早期开发阶段需深度表征抗体的生物学特性，如亲和力，以选择最适合临床需求的候选抗体。

抗体由2个Fab（抗原结合域）和1个Fc（可结晶片段）组成。Fab含互补决定区（CDRs），通过非共价结合识别抗原。Fc结合Fc受体（FcγRs），触发免疫效应（如ADCC/ADCP）。此外，还有一些新型设计，如双抗、ADC、免疫细胞因子融合物等。不同IgG亚型对FcγR的亲和力不同，影响效应功能。可通过一些策略进行改造，比如糖工程（如去岩藻糖基化）增强ADCC；序列或铰链区工程调节Fc柔性或取向；通过抗原结合引发的变构效应，间接调控Fc受体结合。另外，靶点类型也具备一定的多样性，既有可溶性抗原（细胞因子、激素），也有膜蛋白（受体、信号分子）。抗体可以通过阻断配体-受体复合物发挥作用，也可以通过FcγR激活效应细胞（如NK细胞）清除靶细胞，又可模拟多价配体诱导受体聚集（如激活免疫信号）。抗体亲和力并非越高越好，需综合评估亲和力与功能的关系。本文围绕抗体亲和力这一话题展开讨论。

亲和力（Affinity）和亲合力（Avidity）

首先需要区分一个概念亲和力（Affinity）和亲合力（Avidity）。

亲和力（Affinity）指抗体与抗原的“结合强度”，反映抗体与抗原之间的结合紧密程度，由结合速率（kon）与解离速率（koff）共同决定，单位为平衡解离常数（KD=koff/kon）。主要描述CDR与抗原表位之间的相互作用，作用强度依赖非共价作用力，如氢键、范德华力、静电作用等。

亲合力（Avidity）指抗体双价结合带来的“整体亲和力”，由于天然抗体为双价结构，可同时结合两个抗原，这种协同效应称为亲合力（Avidity），可表现为表观亲和力增强。抗体两个Fab臂结合邻近表位（如细胞膜上重复抗原），需同时解离才能释放抗体，显著延长解离半衰期。对于膜抗原，抗体与细胞表面抗原结合后，局部抗体有效浓度升高，第二结合事件更易发生，依赖于细胞密度与抗原表达水平。

下表总结了两个概念的区别。

调节抗体-抗原结合的策略

序列改造调节抗体亲和力

可以利用体外筛选与人工亲和力成熟技术平台，如噬菌体/酵母/哺乳动物展示系统实现。大致流程是，先构建天然抗体文库，后通过PCR随机突变或定点突变生成突变库，再通过多轮筛选逐步提升亲和力。该技术的优势是无动物实验伦理问题，且可精确控制亲和力范围。

也可以利用体内亲和力成熟技术路径，如免疫动物（如表达人源抗体基因的转基因小鼠）后，从记忆B细胞/浆细胞中筛选高亲和力抗体。该技术的优势是可生成天然构象、高亲和力且临床转化潜力高的抗体。缺点是亲和力调控精度低于体外方法。

随着技术的发展，下一代测序（NGS）与AI/ML的协同应用在抗体亲和力改造方面也有一定价值，并可能是未来发展的重要方向之一。NGS可大规模获取抗体编码核酸序列，若已有大量抗体序列及其结合数据，进行AI模型训练，AI/ML可用于预测高亲和力序列，设计突变位点以优化亲和力，或从头设计抗体（denovo design），仅基于靶点信息构建高亲和力抗体。目前已经有一些数据库和资源支持以上操作，如序列数据库OAS（Observed Antibody Space）和PLAb Dab（Patent and Literature Antibody Database）；结构/亲和力数据库SKEMPI、CATH、HER2结合数据集等。不过，截至目前，尚未有经AI/ML设计的抗体进入临床。

通过结构工程提升抗体靶点结合效率

除通过改造序列，“提高亲和力”外，还可通过改造抗体结构（如双特异、多特异、附加功能域）来增强结合效率。

双特异性抗体（bsAbs）指一条抗体分子含两个不同Fab，可同时识别两个抗原或一个抗原上的两个表位。作用模式分为cis和trans两种。Cis结合的两个靶标位于同一细胞。这类分子可以通过“双抗原共表达”提高选择性，减少对单阳性细胞的“on-target/off-tumor”毒性。需精细调节每个臂的亲和力，若某臂亲和力过高，可因单价结合而丧失双价优势。Trans结合指两个靶标位于不同细胞。经典案例包括免疫细胞重定向（如TAA×CD3 T-cell engager，或TAA×CD16A NK-cell engager）。

有双抗，自然有三特异性抗体（trispecifics）。多抗既可以靶向不同抗原，也可以结合同一抗原不同表位，如双表位抗体（biparatopic Abs），比如对于ADC药物，可以促进受体聚集、内化、溶酶体降解，提升ADC的毒素递送效率。

提到表位（epitope），又分为“功能性表位”和“非功能性表位”。功能性表位被结合后可阻断配体、招募免疫细胞、促进ADC内化等。非功能性表位属于即使被高亲和力抗体结合，也不产生治疗收益。所以，高亲和力≠高疗效，应优先靶向关键功能残基或最佳免疫取向的表位。

抗原-抗体相互作用检测

抗体亲和力的测量需根据靶点特性和结合复杂性选择合适技术，避免因实验设计不当而误解靶点结合能力。常用技术分为两类：固定配体类（如SPR、BLI）、活细胞结合类（如流式细胞术、KinExA）

表面等离子共振（SPR）

原理：将抗原或抗体固定在金属芯片表面，实时检测结合/解离导致的光学折射率变化，计算结合速率（Kon）与解离速率（Koff），得出KD值。

优点：高通量、无标记；可测动力学参数

局限性包括：1）生理相关性差：固定抗原可能丧失天然构象，无法模拟细胞膜环境；2）多价结合干扰：实验设计需抑制avidity（如通过低密度固定）；3）缓冲条件与体内差异大（pH、离子强度等）；4）超慢解离难测：需长时间洗脱，KD通常仅能测至低皮摩尔级。

活细胞结合技术：流式细胞术

原理：用不同浓度荧光标记抗体结合表达靶抗原的细胞，通过荧光强度计算半数结合浓度（EC50）和最大结合（Bmax）。

优点：保留抗原天然构象和膜环境，适合模拟生理状态；可检测抗体二价结合导致的avidity效应（如EC50降低但Bmax减少）。

局限性包括：1）EC50≠KD：高抗原表达或avidity会扭曲EC50与真实亲和力的关系；2）假阴性风险：抗原-抗体内吞或细胞表面抗原脱落会降低信号，需低温或固定细胞缓解，但可能降低生理相关性；3）需与动力学技术（如Ligand Tracer）联用以确认平衡状态。

KinExA（动力学排阻法）

原理：KinExA是一种基于溶液的亲和力测定技术，不固定任何分子，维持抗原抗体在天然状态下的平衡。将不同浓度的抗原与恒定浓度的抗体孵育至平衡，然后将混合物通过包被抗原的微珠，在极短时间（<0.5秒）内捕获游离抗体，再用荧光二抗检测，从而推算出游离抗体浓度，计算KD值。

优点：1）生理相关性强：无需固定，保留抗原天然构象；2）适用范围广：可用于膜蛋白、完整细胞、未纯化样品；3）高灵敏度：可测至fM级别；

局限性包括：1）通量较低：一次只能测一个样品；2）背景干扰：血清中内源性IgG可能产生非特异信号。

单细胞相互作用细胞术（scIC/RT-IC）

原理：将表达抗原的活细胞固定在微流控“笼”中，荧光标记抗体在流动中通过，实时监测抗体结合与解离，记录保留时间和荧光强度，评估affinity与avidity。

优点：1）真实细胞环境：抗原处于天然膜状态；2）可测avidity：适合二价或多价抗体；3）动态监测：可观察亲和力成熟后的变化。

缺点是技术门槛高，设备复杂，尚未普及。

功能药理学实验用于亲和力测定

原理：当抗体作为拮抗剂阻断受体-配体结合时，可通过剂量依赖性抑制曲线估算其亲和力。

方法包括：1）Cheng-Prus off修正：适用于竞争性抑制，但需确认非“tight-binding”系统；2）Schild分析：更严谨，适用于高亲和力抗体，可判断是否真正为竞争性结合。

用于亲和力测定的各种方法的范式、优点、缺点和检测范围如下表所示。

亲和力与PK/PD的关系

靶点介导的药物处置（TMDD）

在某些情况下，可溶性靶抗原的大小和功能会决定抗原/抗体复合物的消除速率，这一现象被称为靶点介导的药物处置（TMDD）。一个典型例子是靶向PCSK9的抗体，其整体动力学呈非线性，消除半衰期较短。通过改造CDR，使抗体在内涵体pH6.0时亲和力降低，可让抗体在内涵体中与靶抗原解离并被细胞释放，从而改变PCSK9的药代动力学特征。目前已有多种抗体通过“pH开关”机制设计改善PK。

膜结合靶标也可能出现TMDD：靶抗原可能自然内化，或在与抗体结合后被诱导内化。其对抗体的影响取决于全身抗原表达量与抗体剂量的比例，以及抗体-抗原复合物的内化速率。简单来说，复合物内化会形成非线性清除途径，其中清除速率与抗原表达量、内化速率、抗原/抗体亲和力相关。这可能降低细胞膜上的靶标占有率，对于ADC类药物可能是件好事，对于需要阻断靶点通路或依赖ADCC发挥作用的抗体则不利。

抗体分布

抗体亲和力会影响其组织分布及到达靶部位的有效性。例如，“结合位点屏障假说”（binding site barrier hypothesis）指出，高亲和力抗体难以穿透实体肿瘤，因为它们会被困在肿瘤外层抗原密集区域。此观点还认为高亲和力抗体会呈现出不同的分布特征。

抗体与抗原的相互作用可用于改善治疗性抗体的组织分布。一个显著案例是“脑穿梭”（brain shuttling）技术，该技术能增强抗体对中枢神经系统的穿透性。其原理是通过基因工程让抗体包含一个结合域，该结合域可与介导内源性配体转胞吞作用的受体结合，其中转铁蛋白受体是最常用的靶点。此类策略可能显著改善阿尔茨海默病等疾病的治疗效果。

钩状效应（Hook effect）

“过度拥挤”（Overcrowding）或“自身抑制”（auto-inhibition）是多价、多功能分子的一种特性，可能导致“钩状效应”——即药物浓度过高时疗效反而下降，这在体外实验中常用于蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）的研究。在高浓度下，分子会与任一靶标形成二元复合物，从而阻碍功能性活性三元复合物的后续形成。这一现象在抗体依赖的ADCC以及T细胞和NK细胞衔接子中也需加以考虑。这种双相浓度-效应曲线的形态取决于抗原的亲和力和表达量，因此适合通过基于数学模型的方法进行优化。

另外，双抗对两种可溶性靶标均为单价，且可假设其两个臂的结合是相互独立的。这意味着，在给定抗体剂量下，针对某一靶标的结合位点数量相较于其单特异性亲本抗体减少一半。因此，双抗的有效剂量应为其来源的两种二价“亲本”抗体中较高者的两倍。