《食品科学》：四川农业大学李树红教授等：鲢鱼Cystatin C对冷藏草鱼肉片质构及线粒体途径细胞凋亡的影响

草鱼（

Ctenopharyngodon idella

）是我国主要的经济淡水鱼种之一，肉质肥厚、脆度高口感好、滋味鲜美；虽活鱼鲜销价格低廉，但冷藏生鲜草鱼肉片市场前景看好。近年的研究发现畜禽动物宰后早期的细胞凋亡是宰后由肌肉走向生鲜肉，形成肉品质特征的必然关键过程之一，与质构特性关系密切。

细胞凋亡是指生物为维持内环境稳定，由基因自主控制的一种程序性死亡过程。初步发现肌肉细胞的凋亡与冷藏鱼肉品质如剪切力和持水力相关。小分子的Cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制因子中的重要家族成员，是典型的半胱氨酸组织蛋白酶天然抑制因子，在作为鱼类加工废弃物的组织（如碎肉、皮、卵、肝胰腺等）中广泛分布。在医学领域中的相关研究已经表明Cystatins可以调控细胞凋亡。

四川农业大学食品学院的李龙飞、李树红*、钱邓帆等以鱼源Cystatin C注射处理草鱼肉片，在验证Cystatin C细胞渗透有效性的基础上，研究宰后冷藏0～72 h期间鱼肉片质构品质相关指标的变化，以及在组织学水平测定鱼肉肌细胞凋亡的发生，同时结合线粒体损伤情况及线粒体途径细胞凋亡相关Caspase-3和Caspase-9的活性、蛋白表达水平，综合分析探讨鲢鱼Cystatin C通过调节宰后早期的肌细胞凋亡影响鱼肉品质形成的潜在关系。以期为今后从细胞凋亡调控的角度，深入阐明Cystatin C在鱼肉片保鲜中的机制奠定实验基础并提供一定的理论依据。

1 HmCystatin C渗透有效性分析

采用Western blot分析HmCystatin C的渗透效果，如图1所示，向Cys组注射的HmCystatin C，尽管可能由于蛋白的稳定性下降或降解，相较注射0 h而言后续时间点上均有所减少，但在冷藏72 h内持续存在，且72 h的Con组内源Cystatin C有所上升，可能导致了Cys组蛋白检测值有所波动，但仍略低于12 h值。Carvajal等研究发现，Cystatin C在注射后的35 min内穿过鱼肉肌纤维细胞膜并渗透扩散到鱼肌肉细胞膜内部。此外，团队前期关于HmCystatin C稳定性研究也表明4 ℃条件下其活性在21 d内仍维持80%。

2 HmCystatin C对冷藏草鱼肉片质构特性的影响

剪切力是评价鱼肉新鲜度的重要质构指标，剪切力越低，鱼肉新鲜度越差。由图2可知，两组鱼肉的剪切力均在冷藏12 h后不同程度开始下降，逐渐发生软化；但相对Con组，Cys组在24 h时下降并不明显。此外，72 h的冷藏期内，除0 h外Cys组的剪切力均显著高于Con组（P＜0.05），即便是在48 h两组剪切力都发生明显下降时亦如此。

质构结果如表1所示，冷藏72 h内鱼肉片硬度在两组间的变化趋势基本与剪切力一致（

P

＜0.05）。但同时明显发现，与Con组鱼肉硬度在12 h达到最大值后于24 h开始迅速下降相比，Cys组在24 h时硬度持续保持最高水平，Cys组48、72 h的硬度基本与Con组24、48 h的硬度相当，一方面说明HmCystatin C对肉质变化的影响，在24 h左右体现特别明显，另一方面可知HmCystatin C有助于将草鱼肉片软化劣变延缓至少24 h。此外，草鱼肉片在冷藏期72 h时Cys组弹性显著（

P

＜0.05）高于Con组。

上述结果提示HmCystatin C对冷藏鱼肉片质构品质劣化确有改善作用，HmCystatin C处理后其质构品质至少能够多维持12～24 h。

3 HmCystatin C对冷藏草鱼肉片肌细胞间隙的影响

凋亡的细胞会发生皱缩，导致相邻细胞逐渐分离、间隙增大。由图3与表2可知，随冷藏时间延长，肌细胞排列出现疏松、间隙逐渐增大的现象；24～72 h时Con组细胞间隙均显著高于Cys组（

P

＜0.05），Xiong Xin等的研究表明，凋亡发生对鱼肉细胞间隙有显著影响，且细胞间隙的增加现象可持续整个冷藏期间（0～120 h）。本实验冷藏终点（72 h），Cys组细胞间隙为Con组的67.4%，表明经HmCystatin C处理后能明显延缓这一变化，这与2.2节Cys组剪切力与硬度的变化一致。

4 HmCystatin C对冷藏草鱼肉片组织蛋白酶B/L活性的影响

由图4可知，冷藏72 h内尽管观察到Con组的Cathepsin B/L活性整体上均明显高于Cys组（

P

＜0.05），但两组各自的Cathepsin L活性均未发生特别显著的升高，冷藏24～72 h内两组鱼肉Cathepsin B活性相较于初始值有所上升，且48 h及72 h的Con组显著高于Cys组。团队在对Cathepsin B/L活性进行持续监测（0～5 d）时，发现Cathepsin B/L活性在冷藏4～5 d时才发生更加急剧的上升，明显高于3 d时的活性水平（数据省略），与相关报道结果一致。Cathepsin B/L通常被认为是动物死后水解细胞骨架蛋白的主要蛋白酶，而本研究表明3 d冷藏期内，Cathepsin B/L活性升高明并不明显，因此判断由其导致的结构蛋白水解有限。然而前述实验组冷藏鱼肉片无论从宏观质构品质还是从组织学特性的肌细胞间隙微观表征，均观察到较为明显的变化，因此推测，HmCystatin C对鱼肉质构劣化的延缓作用，除了对Cathepsin B/L的抑制外，很可能还存在其他潜在机制。

5 HmCystatin C对冷藏草鱼肉片中ROS相对含量的影响

ROS是凋亡发生的重要信号分子，线粒体是细胞中产生ROS的主要场所，ROS的不断积累可诱导凋亡级联反应的发生。由图5可知，在0～72 h冷藏期间，两组鱼肉的ROS相对含量呈现上升趋势，说明鱼宰后缺血缺氧的应激条件下导致了ROS的产生。值得注意的是，Con组在24～72 h内，以及Cys组24～72 h内，都发生了ROS先有所下降而后升高的现象。细胞内ROS的产生与消除处于一个动态平衡状态，ROS水平的下降，可能是由于此时细胞内部的抗氧化酶清除了早期产生的ROS，此后由于内环境被破坏使得ROS无法及时被清除而快速上升。在白斑狗鱼以及镜鲤宰后ROS水平测定中也发现类似的波动现象。尽管可能由于注射刺激的原因，导致Cys组12 h时ROS积累，高于Con组，但是整体上Cys组ROS水平低于Con组，特别是24、72 h表现出显著性（

P

＜0.05）。结果表明HmCystatin C处理抑制了肌肉细胞内的过氧化水平。研究表明Cystatin能抑制人牙龈成纤维细胞在病理损伤下发生的ROS升高。值得注意的是，ROS产生与凋亡级联反应的发生密切相关，ROS的积累可造成线粒体功能障碍，导致线粒体膜受损，从而启动线粒体介导的凋亡过程。

6 HmCystatin C对冷藏草鱼肉片肌细胞凋亡率的影响

经典的TUNEL染色法可检测到冷藏过程中凋亡晚期的草鱼肌细胞，凋亡结果见图6及表3。草鱼宰后检测到的阳性凋亡细胞核（图6中黄色圈所示呈棕色或棕褐色）随着冷藏时间延长逐渐增多。Li Hui等同样用TUNEL染色证实了白斑狗鱼宰后冷藏120 h过程中，有细胞凋亡的发生，凋亡肌细胞核的数量显著增加。本实验中Cys组鱼肉细胞凋亡率显著（P＜0.05）低于Con组。到72 h时Con组凋亡率已达82.23%，而Cys组仅为48.3%。说明HmCystatin C处理能明显延缓冷藏草鱼肉片肌细胞的凋亡速率。此外相对于细胞凋亡率初始值，Con组在24 h以及Cys组在48 h后均呈现明显增加趋势，结合细胞间隙随凋亡的发生逐渐增强，说明伴随凋亡率的增高肌纤维组织学特性亦会发生积累性的劣化，这也解释了Con组剪切力和硬度都在24 h开始发生下降，并在48～72 h更为明显，而Cys组剪切力和硬度的下降得到延缓，在48 h才开始发生明显下降。目前在医学方面的研究表明一定浓度范围内的Cystatin C可抑制缺血再灌注导致氧化应激而引发的大鼠脑组织细胞凋亡。此外，有研究表明，随着细胞凋亡的激活，凋亡的细胞膜极性反转会导致凋亡细胞与其他细胞分离，从而导致胞外空间增加，细胞间结构完整性被破坏，使得细胞间隙增大；对畜禽肉的研究发现，冷藏过程中影响肉嫩度形成的组织学特性指标与细胞凋亡显著相关。

7 HmCystatin C对冷藏草鱼肉片中线粒体损伤及形态的影响

线粒体在调控细胞死亡中具有重要作用，线粒体损伤可导致细胞凋亡。线粒体MPTP开放性与膜电位常用于判断宰后肌肉细胞中线粒体受损情况。此外，线粒体MPTP开放在整个凋亡级联反应中发挥重要作用，随着开放程度的不断增加，会促使多种凋亡因子释放，进而激活下游级联反应。如图7a所示，冷藏期间两组线粒体在540 nm处的吸光度不断降低，即MPTP开放性不断增加，线粒体受损越发明显。线粒体膜电位的变化是细胞凋亡典型的早期标志。随冷藏时间延长，线粒体红绿荧光比值（聚合物/单体）不断降低（图7b），即线粒体膜电位由正常的高水平向受损状态的低水平转变，同样指示了线粒体的损伤程度在不断增强。两组的540 nm吸光度与线粒体膜电位在72 h时，相对初始值已发生明显降低，尤其在48 h时下降迅速，这也与此阶段的细胞凋亡率明显增加的结果表现出一致性。但是冷藏期内除初始点（差异不显著）外，Cys组的A540 nm（图7a）以及红绿荧光比值（图7b）均始终显著高于Con组（

P

＜0.05），尤其在24 h内的Con组A 540 nm的下降即MPTP开放性呈现急剧变化趋势，而Cys组的急剧下降则延迟至48 h开始，说明HmCystatin C抑制了冷藏草鱼肌肉细胞线粒体的损伤，在前24 h内的抑制效果尤为显著，且该抑制效果一直持续到72 h。上述MPTP及膜电位在关键时间点24 h及48 h的变化也一定程度上反映了Con组及Cys组硬度及剪切力在24 h及48 h的变化趋势。

Fan Xiaowei等的研究表明，宰后鱼肉在0～12 h内，ATP的逐渐耗尽、pH值环境的改变及ROS的积累可导致线粒体功能障碍，这与本实验中12 h时Con组MPTP已经开始发生急剧变化结果类似。此外，结合前述HmCystatin C处理减少了宰后草鱼鱼肉细胞中ROS相对含量，说明HmCystatin C对MPTP和膜电位表征的线粒体损伤的抑制效果与其抑制了冷藏期间ROS的积累存在潜在关联，即可能由于Cys组线粒体受到的氧化刺激更小，线粒体受损程度更低。Hematyar等认为线粒体功能障碍与蛋白降解高度相关，可将其作为鱼肉鲜度评价的早期指标。而本研究中HmCystatin C对线粒体损伤的抑制与其延缓了冷藏72 h内草鱼肉片质构品质的劣化的确呈现了明显的相关性。

8 HmCystatin C对冷藏草鱼肉片肌细胞线粒体形态的影响

线粒体形态变化更直观地反映了线粒体的损伤情况，如图8所示，冷藏0 h时，两组线粒体膜清晰，嵴的结构良好，线粒体无肿胀，膜间隙无扩张。随冷藏时间延长，两组发生不同程度的线粒体膜肿胀，嵴组织扩张，呈空泡状；但Cys组直至72 h才发生线粒体嵴部分消失，基质致密化，而Con组损伤明显更为严重，在24 h时线粒体嵴排列杂乱无章，线粒体嵴逐渐消失，72 h仅残留少量肿胀线粒体嵴，线粒体基质消失。可见HmCystatin C处理后能明显减轻线粒体损伤，这与其抑制MPTP开放及膜电位降低的结果完全符合。目前在宰后冷藏的畜禽肉及鱼肉中，都发现了随着冷藏时间的延长线粒体结构逐渐发生破坏，畜禽肉冷藏3 d可观察到线粒体明显破坏，鱼肉冷藏6 h便已观察到线粒体损伤，到72 h时线粒体已明显破坏。Li Xue等发现经

N

-乙酰半胱氨酸处理冷藏的白斑狗鱼肉肌肉细胞线粒体结构相比未处理组更为完整，但是

N

-乙酰半胱氨酸作为药物无法在水产品中应用。

9 HmCystatin C对冷藏草鱼肉片Caspase-3、Caspase-9活性及蛋白表达的影响

Caspase-9是线粒体途径中典型的凋亡起始酶，可被线粒体内释放的细胞色素c激活，进而活化下游的凋亡效应酶Caspase-3执行细胞凋亡程序。Caspases介导的凋亡被认为一直持续整个僵直期和解僵自溶成熟的早期。而鱼死后的生化反应速度及僵硬、解僵和自溶进程都更快，因此控制Caspases活性及其介导早期细胞凋亡的进程，对于鱼肉片品质的保持具有重要意义。Cystatins作为半胱氨酸蛋白酶的特异性抑制因子，在团队前期的体外实验中，对活性中心依赖半胱氨酸残基的Caspases能够表现抑制活性。本实验中，HmCystatin C处理前后的两组Caspase-3及Caspase-9活性变化分别如图9a、b所示。在冷藏期内Cys组两种酶的活性整体呈下降趋势，前12 h与Con组差异不大，但24 h时HmCystatin C处理后的Cys组Caspase-3、Caspase-9活性明显下降，加之未经处理的Con组两种酶活性急剧上升，因此此时Cys组都显著低于Con组（

P

＜0.05）；此后，尽管Con组24 h后的各点活性逐步回落至基本与初始点持平，但Cys组Caspase-3、Caspase-9活性在72 h时均又发生明显的降低，尤其是Caspase-3的活性，导致72 h时Cys组两种酶活性仍显著（

P

＜0.05）低于Con组。

本实验亦从蛋白水平上检测了Caspase-3、Caspase-9的表达情况（图9c、d），有关畜禽及鱼类Caspase-3的研究已经表明，该酶可由35 kDa左右的前体转化为23 kDa和17 kDa的两个活性片段。本实验中得到类似结果，草鱼Caspase-3活化体如图9c中红色箭头所示。与酶活性检测结果一致，Cys组两种酶蛋白（前体及活性体）的表达量都在整体上呈现为低于Con组。在医学领域的相关研究表明，适宜浓度的Cystatin C对脑缺血再灌注导致的Caspase-2、Caspase-9蛋白表达升高有明显的抑制作用。

此外，由于实验中检测的主要为Caspase-3、Caspase-9的前体形式，因此各组内的蛋白表达趋势与酶活性略有不同；特别是Con组Caspase-3和Caspase-9的前体均在前12 h表达量最高，而后逐渐下降，与其酶活性在24 h时最高有所差异，这可能是由于前体向活性体转化以及酶活性的积累，尚需一定过程。

综上，HmCystatin C处理整体上抑制了冷藏期间线粒体途径凋亡相关的凋亡起始酶Caspase-9及凋亡效应酶Caspase-3的活性和蛋白表达水平，该抑制作用在前12～24 h内尤为明显，且酶活性在冷藏结束72 h时，仍处于被有效抑制的状态。结合本实验中冷藏期间两组细胞凋亡率及线粒体功能、形态变化趋势和差异，推测HmCystatin C处理能够延缓Caspase-3、Caspase-9介导的线粒体途径的细胞凋亡进程，且在12～24 h内开始发挥显著作用，并能够在72 h内持续维持。动物肉宰后品质形成不仅与细胞凋亡导致的细胞形态变化有关，更为重要的是细胞凋亡的核心酶系Caspases还能参与骨架蛋白的水解，在宰后肉的成熟中发挥重要作用。凋亡相关核心酶Caspase-3、Caspase-9激活后能够对牦牛肌原纤维蛋白进行降解，参与了宰后肉质构的形成，而Caspase-3活性则与剪切力变化显著相关。因此，这也合理解释了本实验中冷藏72 h内，Caspase-3和Caspase-9活性及表达被显著抑制的Cys组，其草鱼肉片质构（剪切力和硬度等）一直优于Con组，特别是在24 h出现与Con组差异显著的原因。

10 草鱼肉片品质指标与线粒体途径肌肉细胞凋亡各指标的相关性分析

对冷藏草鱼肉片各质构品质相关指标（剪切力、硬度、细胞间隙）与线粒体途径细胞凋亡相关各指标（ROS、线粒体通透性与膜电位、Caspase-3活性、Caspase-9活性、凋亡率）进行相关性分析，结果如图10所示。由于Caspase-3、Caspase-9的作用具有积累性，因此采用积累性酶活性进行相关性分析。剪切力、硬度、细胞间隙质构指标与ROS、MPTP、膜电位、Caspase-3及Caspase-9的积累酶活性、细胞凋亡率均呈相关性，其中剪切力与上述ROS、MPTP除外的4 个凋亡相关指标呈显著相关（P＜0.05）。硬度与膜电位和凋亡率呈极显著相关（P＜0.01），与Caspase-3及Caspase-9积累酶活性呈显著相关（P＜0.05）。类似的铁槐茂也发现冷藏5 d内的草鱼剪切力与凋亡率呈极显著负相关；冷藏牦牛肉背长肌剪切力与Caspase-3活性变化显著相关。细胞间隙与线粒体途径细胞凋亡各指标相关，但不显著（ROS除外）。由此可知，线粒体途径细胞凋亡显著或极显著地影响了冷藏草鱼肉片的质构品质，对细胞间隙的增加起到一定作用。

鱼肉片组织中ROS水平与剪切力呈现一定负相关，与硬度及细胞间隙呈显著相关（

P

＜0.05），提示组织ROS水平能够在较大程度上反映鱼肉质构品质的变化；同时ROS水平又与MPTP、膜电位呈现一定负相关，与Caspase-3及Caspase-9积累酶活性及细胞凋亡率呈显著正相关（

P

＜0.05），提示通过ROS诱导的线粒体途径的凋亡与质构品质的变化密切相关。

基于上述相关性分析以及HmCystatin C处理后对线粒体途径凋亡的显著抑制，说明HmCystatin C对冷藏草鱼肉片质构品质劣化的延缓作用与其抑制线粒体途径的细胞凋亡关系极其密切，因此，这也是其改善冷藏鱼片品质的作用机制之一。

结 论

HmCystatin C注射处理草鱼鱼肉片可有效渗透到草鱼肌肉组织内部，显著延缓了质构劣变，降低了鱼肉组织内ROS的水平；同时明显抑制了肌肉细胞的凋亡率以及可能由此产生的肌细胞间隙的增加。冷藏72 h内组织蛋白酶B/L活性增加并不明显，尤其具有强力内肽酶活性的组织蛋白酶L，因此HmCystatin C对草鱼鱼肉质构品质劣化的延缓作用，存在除抑制组织蛋白酶B/L活性之外的其他潜在机制。草鱼肉片冷藏期间质构相关指标与鱼肌肉细胞凋亡指标、线粒体损伤程度呈现明显相关性，加之HmCystatin C处理能够显著抑制草鱼肌肉细胞线粒体功能损伤和形态破坏，以及抑制线粒体途径凋亡相关起始酶Caspase-9、执行酶Caspase-3活性和蛋白表达水平；因此综上判断，HmCystatin C通过抑制调控鱼宰后肌肉线粒体途径的细胞凋亡进程，是其改善草鱼鱼肉片在冷藏72 h内的质构品质劣化的重要潜在机制。

在探索通过外源调控细胞凋亡延缓鱼肉软化方面，相对于目前多数研究采用的无法在食品加工中使用的Caspases广谱或Caspase-3特异性化学抑制剂如Z-VADFMK、AC-DEVD-CHO，小分子HmCystatin C为鱼源的天然活性抑制因子，安全性高，且在加工废弃物中广泛分布，易于制取；HmCystatin C处理将质构品质劣化延缓至少24 h，这对规模化的冷藏鱼片水产品加工企业或销售终端而言，都将十分有利，同时鉴于其还具有抑制鱼肉内源蛋白酶、抑制水产品腐败微生物的多重活性，因此鱼源HmCystatin C极具作为水产品生物保鲜剂的良好开发前景。

本文《鲢鱼Cystatin C对冷藏草鱼肉片质构及线粒体途径细胞凋亡的影响》来源于《食品科学》2025年46卷第15期145-154页，作者：李龙飞，李树红*，钱邓帆，蒋宇维，仝浩楠，李晓菲，白水萌，张颖，李冉。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250306-041。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：刘芯；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网