ADC药物非临床研究策略及案例分享

抗体药物偶联物（ADC）是两种不同类型分子的偶联物，常见组合是一端为单抗，另一端是小分子药物载荷。因此，ADC的非临床安全性评估既要考虑对ADC整体的评价，也要考虑载荷带来的风险。目前专门针对ADC非临床评价的指导原则不多，可以参考NMPA 2023年9月发布的《抗体偶联药物非临床研究技术指导原则》，也可以参照一些涉及ADC的通用型指南，比如ICH M3（R2）、ICH S6（R1）、ICH S9及Q&A。结合已有指南和公开文献，围绕ADC这类产品的非临床研究内容做下分享。

药理学研究

主要药效学研究

可通过多种体外和体内实验评估ADC及其组成部分的临床前药效学活性。大致研究内容包括与目标靶点的结合能力（含特异性）、内吞能力、靶细胞杀伤能力（ADCC/CDC/载荷毒性）、载荷解离能力、旁观者效应、组织交叉反应、体内抗肿瘤作用、PK/PD等研究。文末罗列了13款已上市ADC的药理学研究内容。

组织交叉反应研究（TCR）：根据ICH S9问答文件，组织交叉反应试验意义有限，通常不需要开展。当无药理学相关种属时，首次人体试验（FIH）应考虑组织交叉反应研究或其他替代方法，与NMPA的思路一致。不过，如ADCETRIS、Trodelvy、Elahere、TIVDAK等已上市ADC，大都开展了TCR试验的。

次要药效学研究

ADC是高活性药物，如果单抗是新分子，建议在研发早期开展下脱靶研究，提前排除风险。不过，不属于申报强制要求内容之列。

安全药理学研究

ADC对心血管、呼吸和中枢神经系统功能的潜在影响通常作为标准GLP重复给药毒性研究的一部分进行评估，即大家通常理解的伴随开展。心血管/呼吸评估通常在活动受限的动物中进行，包括心电图（ECG）检查，测量PR间期、QRS波群、QT间期、校正的QT间期（QTc），特别关注QT间期延长风险。同时还需测量心率和血压。神经学评估包括对环境刺激的反应、眼部、运动反射、感觉功能和体温的评估等。

还是以T-DM1为例，开展了雌性食蟹猴单次给药安全药理学研究，使用外科植入的遥测发射器进行心血管安全性评估，以及在重复剂量研究中对相同剂量水平的心电图和心率进行评估。在两项研究中均未观察到QT延长。在遥测动物中观察到血压一定程度升高，但在重复给药毒理研究中未发现相应的显微镜下病变。其单抗成分（曲妥珠单抗）的临床前研究也未发现心脏毒性，且在患者中进行的T-DM1治疗剂量的QT研究中观察到的异常反应极小。然而，在需要停用T-DM1的患者中观察到低发生率的高血压。接受曲妥珠单抗治疗的患者发生左心室功能障碍的风险增加，接受ADC治疗的患者风险相似。在食蟹猴中进行的T-DM1神经学评估中未发现异常。然而，在坐骨神经和脊髓背索中观察到剂量依赖性的显微镜下轴突变性，在6周的研究恢复期内未显示出可逆性。TCR研究结果显示，在胶质细胞和周围神经梭形细胞中出现低强度膜染色，证实了该毒性是供试品相关的。

载荷的安全药理学：除了体外hERG试验外，通常不单独对载荷进行安全药理学评估。hERG钾离子通道在心肌复极化中起重要作用，其阻断与QT延长和尖端扭转型室性心动过速相关。由于载荷可能存在于循环中，会检查小分子载荷对钾离子通道的浓度-反应关系。对DM1载荷的hERG试验评估发现，其IC50高于受试的最高剂量水平，比接受T-DM1的患者检测到的DM1浓度至少高30倍。

药代动力学研究

ADC临床前PK评估范围无统一标准，需基于分子特征确定。ADC由单抗、小分子载荷和连接子组成，其临床前PK评估内容广泛。完整的ADC临床前PK研究需通过体外和体内实验，分别评估单抗、载荷（可能包括载荷-连接子片段代谢物）等单个组分，以及完整ADC的药代动力学特征。

尽管ADC的治疗目标之一是减少游离载荷的全身暴露，但循环中载荷的意外释放及药物制剂中少量游离载荷的存在难以避免，因此需全面表征载荷的PK特征以明确潜在安全风险。

对于新载荷，载荷的临床前PK表征包括大小动物PK、组织分布试验、排泄试验、血浆稳定性试验、体内外代谢产物鉴定、体外代谢稳定性、CYP450相互作用（抑制、诱导及反应表型分析）、血浆蛋白结合率、外排与内流转运体检测等。若载荷已有充分研究，可参考已发表文献中的非临床PK数据，替代或补充新增PK实验。可以考虑采用放射性标记技术开展。

已获批ADC产品开展的非临床分布、代谢和排泄研究汇总如下：

围绕CYP450和转运体相关研究额外聊几句。由于毒素的人体暴露量非常低，远低于影响体外代谢酶、转运体的IC50，因此大部分情况下毒素分子诱导或抑制酶、转运体的风险比较低。比如，体外研究显示，MMAE、DM-1对肝药酶CYP3A的抑制浓度在微摩尔水平，但携带这两个毒素的ADC产品brentuximab vedotin和T-DM1临床拟用剂量下的毒素暴露量在纳摩尔级别。实际上，brentuximab vedotin开展的临床DDI研究显示，与CYP3A底物咪达唑仑联合用药，并未影响其暴露量，与体外数据推导的结论是一致的。采用体外DDI和临床数据构建的PBPK模型再次确认了MMAE的低CYP3A抑制风险。然而，毒素分子作为DDI victim的风险是存在的，即毒素有可能是肝药酶或转运体的底物，与诱导或抑制酶、转运体的药物联用，可能会影响ADC产品的疗效或安全性。比如MMAE、DM1、DXd均是CYP3A的底物。

稳定性研究：连接子的稳定性是影响ADC安全性最重要的因素之一。这一观点在ICH S6(R1)和S9指南中均有所体现，ADC的稳定性应在人以及非临床种属的血浆中进行评估。尽管尚未建立评估ADC稳定性的科学最佳实践方法，但体外稳定性通常通过在37℃下，持续3到7天，测定人以及非临床种属血浆中药物抗体比（DAR）的变化。从监管角度来看，这些研究的主要目的是确定重复给药毒理学研究获得的数据是否能够代表潜在的人体情况。另外，在进入IND enabling之前的早期研究中，就应获得ADC内化、裂解及裂解后主要游离小分子化合物信息，这点CDE之前的培训中也有提示，如下图所示。血浆稳定性研究是小分子体外ADME中的常规内容之一。

ICH S9指南还要求，关键毒性研究中的毒代动力学评估（需关联毒性发生情况的动物PK数据）需同时涵盖完整ADC和游离载荷。常用方法为检测给药后血清或血浆中ADC、总抗体（ADC加未结合抗体）及游离载荷的浓度，并计算各分析物的PK参数。

ADC需验证多种不同的生物分析方法。血清中ADC和总抗体浓度通常采用配体结合试验检测，血浆中游离载荷则通过液相色谱-质谱联用技术定量。

毒理学研究

种属选择

ADC毒理研究的种属选择遵循与单抗相同的原则。通常需要评估两个种属，一种啮齿类动物和一种非啮齿类动物。当然，必须选择具备药理学活性的相关动物种属进行评估。ICH S9 Q&A进一步指出，当ADC的抗体部分仅与人和非人灵长类动物（NHP）抗原结合时，仅在NHP中进行安全性评估是合适的。事实上，与大多数治疗性单抗一样，ADC与靶点之间的高亲和力相互作用通常会排除啮齿类动物的交叉反应性。

那么如何确定相关动物种属呢？首先，应基于已发表的氨基酸序列数据，比较人类与常用毒理研究种属（如小鼠、大鼠、犬、小型猪和NHP）之间的靶点序列同源性。同源性越低，种属的相关性越小。此外，可进一步评估ADC与不同毒理研究种属和人体之间的靶点结合亲和力，可通过表面等离子体共振分析或细胞结合实验完成。如果某个种属的靶点亲和力较低，则可能无法检测到靶点相关的毒性。如果与人的结合亲和力相差超过10倍，可能需要在确定首次人体（FIH）剂量水平时增加额外的安全系数。当然，亲和力还只是药理作用发挥的前提，如果条件允许，最好有功能相关的数据支持。另外，通过免疫组化或RNA表达谱可以探索靶点表达和分布，识别潜在的靶器官，并判断人类与毒理研究种属之间是否存在相似性（靶向）或差异（非靶向）。

如果没有相关动物种属怎么办呢？根据ICH S6建议，当无法找到相关动物种属（即受试物无法与任何动物种属中的同源靶点相互作用）时，可以考虑使用替代分子或转基因模型。以Polatuzumab vedotin为例，一款靶向CD79b的ADC，CD79b表达于B细胞。尽管人和食蟹猴的CD79b表位之间仅存在三个氨基酸的差异，但该ADC仅能结合人体靶点，即不存在相关动物种属。因此，开发了一种能够结合食蟹猴CD79b且包含相同连接子-载荷的替代ADC，用于安全性评估。在进行毒理研究之前，比较了替代ADC和人类ADC的活性。Polatuzumab vedotin和替代ADC分别对人类和食蟹猴的B细胞具有相似的结合亲和力。此外，体外血浆稳定性、体内抗肿瘤活性以及小鼠药代动力学数据也显示了两种ADC之间的可比性。尽管这不是监管要求，但Polatuzumab vedotin和替代ADC均在食蟹猴的GLP毒性研究中进行了给药。正如预期的那样，只有接受替代ADC的动物外周CD20阳性B细胞数量减少。然而，替代ADC和Polatuzumab vedotin均在食蟹猴中引起了载荷相关的毒性。

ADC结构中毕竟含有小分子载荷组分，所以还要额外考虑载荷的安全性评估。对于载荷，种属选择标准则要遵循小分子路径。不过，毕竟载荷本身并非临床试验药物，因此可以仅做有限性评估。对于已有充分研究信息的载荷，比如MMAE、MMAF、DM-1、Dxd等等，载荷毒性可以通过整体ADC的给药实现。对于新分子或毒性特征不明确的载荷，根据NMPA《抗体偶联药物非临床研究技术指导原则》要求，需要按照创新小分子化合物的一般毒性研究原则，获得其在啮齿类和非啮齿类动物中的毒性反应信息，且需要至少在一个动物种属中进行单独的毒性考察，该考察可以是采用游离小分子化合物给药的独立试验，也可以在 ADC 的毒性研究中设置游离小分子化合物给药组。根据抗体和载荷的相关种属情况，会有几种不同的策略，之前益诺思分享过一个表格，比较直观，此处借用、分享如下。简单一句话就是，对于载荷来讲，啮齿类相关，则首选啮齿，反之，仅猴相关，则选猴。大部分情况应该是，抗体部分仅猴为相关种属，载荷部分则大鼠和猴均相关，故开展ADC猴毒理+单独载荷大鼠毒理组合研究。或者抗体部分和载荷部分大鼠和猴均相关，则开展ADC大鼠和猴毒理，同时大鼠试验中增设1组单独的载荷组。

关于这部分，CDE也分享过资料，如下图所示，逻辑是一样的。

支持IND的一般毒理研究

ICH S9 明确指出，对于结合型产品，完整ADC的安全性是主要关注点。在S9问答文件中进一步明确，ADC的整个分子应在至少一个种属中进行测试，单抗不必单独研究。此外，对于未结合的物质（如载荷）的安全性评估，可以进行有限的评估。关于载荷的毒性评价，ICH S6建议遵循新化学实体的方法，即进行完整的包括两个种属的非临床毒理学评估。当然，抗肿瘤产品还是以ICH S9要求为主。

在GLP非临床研究中，药物给药途径必须与临床试验中使用的途径完全一致。生物制剂容易降解，因此给药途径通常限于注射方式，如静脉输注、皮下注射、皮内注射或肌肉注射。如果需要改变临床给药途径，则需要额外的动物研究来评估药物分布的变化并确定安全性。

初步安全性评估可能包括剂量范围探索研究或其他非GLP研究，以帮助确定最大耐受剂量（MTD）并选择用于正式GLP研究的剂量水平。对于ADC分子，不需要进行急性毒性研究。重复给药毒性研究包括对动物健康状况的评估，包括行为变化、外观、体重、摄食量、临床病理学参数以及器官和组织的显微镜检查等。重复给药毒性试验中应考虑药物毒性靶器官，并在适当的情况下评估潜在的可逆性。通过这些研究，可以为FIH临床试验的起始剂量选择提供依据。

支持IND的GLP研究的给药周期应支持预期的临床给药计划，通常取决于分子的半衰期。单抗的半衰期通常支持每周或更少频率的给药。在非临床和临床研究中，ADC的给药频率倾向于每3周给药一次（Q3W），以提高对载荷的耐受性。ADC在第1周给药，随后2周不给药，视为一个治疗周期。根据这种给药方案，单次给药后进行2周观察期通常被认为可以支持FIH试验。然而，S9问答文件特别指出，毒性研究中至少需要两次ADC给药以支持初始临床试验（即在研究第1天和第22天给药）。需要注意的是，第二次给药后的毒性通常大于第一次给药后的毒性。动物毒性研究中的给药频率应支持临床中的给药频率，因此毒性研究的给药间隔可以设为2周或3周。

以曲妥珠单抗美坦新（trastuzumab emtansine，T-DM1）为例，进行了两项重复给药的非人灵长类动物（NHP）研究。第一项研究为4次重复给药，每3周给药一次（Q3W），剂量范围为3~30 mg/kg，最长恢复期为6周。TCR研究确认了人和NHP正常上皮组织中HER2的表达情况。载荷DM1的作用机制是抑制微管聚合，导致有丝分裂中期阻滞。T-DM1相关发现包括肝脏、骨髓/血液学（主要是血小板）、淋巴器官毒性以及处于有丝分裂中期阻滞的上皮细胞和髓系细胞数量增加。

ADC中的载荷部分通常是一种毒素，用于杀死ADC靶向的癌细胞。尽管ADC的安全性评估是最重要的，但动物中观察到的毒性通常与载荷有关。不同的载荷类别对应的特定毒性已大致清楚。如果载荷之前已经经过评估，则可能不需要额外进行GLP毒性研究或进一步评估。对于一种新型毒素，通常需要在毒性研究中进行表征，研究通常在啮齿动物中进行。这可能是一项多剂量的单次给药研究，并随后进行短暂的恢复期观察。研究需设置标准的毒理学参数（如临床观察以及临床和解剖病理学）。已上市ADC载荷的分类、作用机制、动物和人体毒性特点总结如下表所示。

ADC的最后一个组成部分是连接子，它负责将毒性载荷与单抗结合。单独研究游离连接子相关的毒性可能并不必要。在一些毒理学研究中，分别对载荷和连接子-载荷进行了考察，结果显示毒性相似且与小分子相关，这表明与载荷相关的毒性相比，连接子相关的毒性较小。

支持晚期临床或上市的重复给药毒理研究

如果计划在临床试验中改变给药方案或给药方式，且与之前在动物研究中考察的不同，则可能需要额外进行毒性研究。

如果方案不变，在关键的Ⅲ期临床试验之前，可能需要进行一项更长周期的GLP重复给药毒性研究。对于用于肿瘤治疗的ADC，通常3个月的研究足以支持后续开发。即使抗癌药物被证明能延长患者生存期，或应用于非立即危及生命的其他肿瘤适应证，通常也不需要额外进行一般毒理学研究。在目标人群中获得的临床安全性数据比在额外动物研究中生成的数据更能用于评估人体风险。

遗传毒性

生物制品无需进行遗传毒性研究，因为它们不会与DNA或其他染色体物质直接相互作用。因此，ADC整体无需进行遗传毒性评估。然而，ADC的另外两个组分——连接子和载荷，则要考虑。

先看下连接子。连接子分为可切割和不可切割两类。可切割连接子可在细胞内的酶或化学条件下释放载荷，而不可切割连接子则始终与抗体共价结合。通常无需单独对连接子进行评估，但进行体外QSAR测试是一个很好的初步判断方法。QSAR评估对细菌回复突变试验（Ames试验）的结果具有很高的预测性，如果连接子分子在适当的QSAR评估中未触发任何潜在致突变结构警报，则可被视为非致突变性物质，无需进一步测试。如果识别出结构致突变性警报，则需要进一步测试。载荷也可以包括在QSAR初步评估中。

载荷部分需要进行遗传毒性评估。标准的试验组合包括体外和体内试验，以确定药物是否诱导遗传损伤。通常，体外Ames试验可能足以支持IND申请。如果结果为阳性，则无需进一步测试。如果Ames试验为阴性，但体外染色体损伤试验（如染色体畸变、微核或小鼠淋巴瘤tk⁺/⁻试验）为阳性，则应考虑进行体内遗传毒性测试。需要注意的是，由于Ames试验使用的是细菌，因此仅对真核细胞有毒性的载荷可能会测试为阴性。在启动2期临床试验之前，需要完成完整的遗传毒性试验组合，通常包括两项额外的研究：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验和体内啮齿动物骨髓微核试验。

如果载荷之前已经进行过遗传毒性评估，这些数据可能足以支持ADC的后续开发。要根据载荷具体情况case by case分析。

生殖毒性

根据ICH S9，拟用于晚期肿瘤患者的药物临床试验或上市，生育力、早期胚胎发育毒性试验和围产期毒性试验不是必需的。生育力损伤评估可以在一般毒性研究中伴随考察。虽不是必需，抗肿瘤药物的胚胎-胎儿发育毒性研究可以在提交上市申请时完成。对于小分子药物，应在两个种属中进行评估；对于生物制品，应在相关种属中进行评估。对于具有遗传毒性和靶向快速分裂细胞的药物，这些研究也不需要。ADC的载荷大多属于这类，直接靶向微管或DNA来杀死癌细胞，最终破坏细胞分裂，故大多无需提交。

如果生物制品的目标患者群体预期寿命较长，则可以考虑在NHP中开展增强的围产期发育研究。然而，在进行此类研究之前，应首先考虑通过作用机制或敲除小鼠模型等信息进行生殖风险的证据权重（WOE）评估，以评估对胚胎-胎儿发育的生殖危害。如果WOE明确表明存在风险，则无需进行NHP研究。靶向相同通路的其它药物的结果，也可作为WOE评估证据之一。例如，T-DM1的载荷DM1已在小鼠中显示出胚胎毒性、致畸性和染色体断裂性。大鼠静脉注射DM1（0.07-0.2 mg/kg）后，其体内的血浆浓度与接受3.6 mg/kg T-DM1每三周一次治疗的患者体内血浆浓度相当。因此，患者将暴露于会导致胎儿损害的DM1浓度。因此，T-DM1的药物标签上有黑框警告，提示胚胎-胎儿毒性。

致癌性

致癌性研究的要求通常取决于药物类别和适应症。对于治疗晚期癌症的药物，不需要进行致癌性研究。然而，如果ADC用于治疗治愈率高且疾病复发率低或复发延迟时间长的适应症，则可能需要开展相关研究。

其他毒性

局部刺激性试验可考虑伴随重复给药毒理研究开展。

溶血性研究参见《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》。

过敏试验通常无需开展。

光安全性：在1期临床试验前，应评估潜在风险，并进行临床风险控制。应在3期前提供符合ICH S10所述原则的光安全性评估。

免疫原性/免疫毒性：免疫原性可伴随重复给药毒性开展。免疫毒性方面，由于ADC的细胞毒性载荷会导致快速分裂细胞（如骨髓祖细胞）的死亡，免疫抑制是可以预期的。对于抗癌药物而言，标准毒性研究中对免疫细胞（如淋巴细胞和B细胞）的影响评估通常是足够的。然而，对于其他适应证，可能需要根据ICH S8指南中概述的策略视情况进行额外评估。

最后

最后大体总结下非临床毒理研究需要开展的内容，按照完整ADC、抗体和载荷进行分类，并罗列了各项研究拟提交的阶段。

为方便大家查阅，将之前总结的13款ADC非临床药理毒理研究内容也一起放在文末，供参考。

Mylotarg是由Pfizer公司开发的靶向CD33的ADC产品，通用名Gemtuzumab ozogamicin。2005年5月17日退市，2017年9月1日重新获批上市，用于急性髓系白血病的治疗。由于是第一款ADC产品，毒素分子Calicheamicin的背景数据不多，因此非临床研究内容比较全面。

ADCETRIS是由Takeda/Seattle Genetics公司开发的靶向CD30的ADC产品，通用名Brentuximab vedotin。2011年8月19日获批上市，用于复发或难治性系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）、复发或难治性经典型霍奇金淋巴瘤（cHL）等疾病的治疗。是第一款毒素为MMAE的ADC产品。同样，毒素分子比较新，对毒素分子的体外代谢、毒理特点、hERG、作用机理等进行了单独、详细研究。

Kadcyla是由ImmunoGen/Roche公司开发的靶向HER2的ADC产品，通用名Trastuzumab emtansine，叫的比较多的名字是T-DM1。2013年2月22日获批上市，用于HER2阳性乳腺癌的治疗。是第一款毒素为DM1的ADC产品，也是首个作用于实体瘤的ADC产品。考虑到DM1是全新毒素，非临床部分研究如下图所示，非常系统。

Besponsa是由Pfizer/Celltech公司开发的靶向CD22的ADC产品，通用名Inotuzumab ozogamicin。2017年8月17日获批上市，用于急性淋巴细胞白血病的治疗。毒素与首款上市的ADC产品Gemtuzumab ozogamicin类似，都是采用的Calicheamicin，即可使DNA双链断裂的卡奇霉素。考虑到Calicheamicin药理作用、毒性特征和代谢特征已开展过详细研究，特点已经比较明确，非临床研究未再对毒素部分进行详细表征。整体非临床研究内容也精炼了很多。

Lumoxiti是由阿斯利康/Innate pharma公司开发的靶向CD22的ADC产品，通用名Moxetumomab pasudotox。2018年9月13日获批上市，用于复发或难治性毛细胞白血病的治疗。推测毒素PE38是蛋白毒素的原因，非临床研究未对毒素分子的体外代谢和毒理学特征进行单独表征。目前为止，已上市的ADC产品中，只有Lumoxiti采用了该毒素。

Polivy是由Roche/Seattle Genetics公司开发的靶向CD79b的ADC产品，通用名Polatuzumab vedotin。2019年6月10日获批上市，用于弥漫大B细胞瘤的治疗。是第二款采用MMAE作为毒素的ADC产品。但依然对MMAE进行了单独的安全性考虑，并较ADCETRIS额外开展了光毒性研究。不过，体外代谢部分，因MMAE的代谢特点已经比较清楚，未开展过多的单独研究。

PADCEV是由Agensys/Seattle Genetics公司开发的靶向Nectin-4的ADC产品，通用名Enfortumab vedotin，毒素为MMAE。2019年12月18日获批上市，用于尿路上皮癌的治疗。

Enhertu是由一三共/阿斯利康公司开发的靶向HER2的ADC产品，通用名Trastuzumab deruxtecan，毒素为Dxd。2019年12月20日获批上市，用于HER2阳性乳腺癌、胃癌的治疗。

Trodelvy是由吉利德公司/Seattle Genetics开发的靶向Trop-2的ADC产品，通用名Sacituzumab govitecan，毒素为SN-38，是伊立替康的活性代谢产物。2020年4月22日获批上市，用于三阴乳腺癌、尿路上皮癌的治疗。

Akalux是由Rakuten aspyrian开发的靶向EGFR的ADC产品，通用名Cetuximab sarotalocan，毒素IRDre700DX，是一种光活性化学物质，通过近红外照射后，激活并杀死癌细胞。2020年9月25日获批上市，用于头颈癌的治疗。

Lonca是由ADC therapeutics SA开发的靶向CD19的ADC产品，通用名Loncastuximab tesirine。首个以PBD为毒素上市的ADC产品。2021年4月24日获批上市，用于弥漫大B细胞瘤的治疗。

TIVDAK是由Genmab/Seagen开发的靶向TF的ADC产品，通用名TISOTUMAB VEDOTIN，毒素为MMAE。2021年9月22日获批上市，用于胃癌或转移性宫颈癌的治疗。

Elahere是由ImmunoGen开发的靶向FRα的ADC产品，通用名Mirvetuximab Soravtansine。首个以DM4为毒素上市的产品。2022年11月获批上市，用于卵巢癌的治疗。

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