元码智药构建基于无痕环状RNA的CAR-T平台

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元码环化策略|

前面三期内容，我们详细介绍了元码智药独创的基于待环化序列内源性二级结构的环状 RNA 平台，本期内容，我们一起来看看元码智药借助环状 RNA 技术，如何构建体外和体内的 CAR-T 平台。

基于无痕环状 RNA 的体外 CAR-T 平台

CAR 的表达强度和时间

基于 Hi-Scarless-PIE 环化策略，构建 anti-CD19 CAR-circRNA。将 anti-CD19 CAR-circRNA 电转进人原代 T 细胞，检测 CAR 转染效率和表达效率。在电转后第 1 天、第 2 天、第 4 天，CD19-circRNA 组中 CD19 阳性细胞比例分布为 83%、84%、32%，而线性 CD19-mRNA 组中 CD19 阳性细胞比例分布为 75%、60%、1%。与线性 CD19-mRNA 相比，CD19-circRNA 在 T 细胞中表达持续时间更长，在 T 细胞表面拥有更高密度的 CAR 分子表达。

此外，研究者还制备了 BCMA-circRNA/GPRC5D-circRNA，电转 T 细胞后，CAR 表达的持续时间和强度均优于线性对照组。

CAR-T 的肿瘤细胞杀伤活性

研究者将电转 CD19-circRNA 制备的 CAR-T 细胞与靶细胞按照不同的效靶比共培养，检测 CAR-T 细胞体外的杀伤能力。Nalm‑6（人 B 淋巴白血病细胞）和 Raji 细胞（人 Burkitts 淋巴瘤细胞）表面高表达 CD19 蛋白，而 K562 细胞（人慢性髓系白血病细胞系）表面不表达 CD19 蛋白。

电转后第一天的 CAR-T 细胞与肿瘤细胞共培养时，CD19-circRNA 组与线性 CD19-mRNA 组对 CD19 阳性的肿瘤细胞杀伤能力相似；电转后第四天的 CAR-T 细胞与肿瘤细胞共培养时，CD19-circRNA 组对 Nalm‑6 的杀伤能力显著强于线性 CD19-mRNA 组，而线性 CD19-mRNA 组对 Raji 细胞没有表现出杀伤能力。同时，在杀伤 Nalm‑6 和 Raji 细胞过程中，CD19-circRNA 组要比线性 CD19-mRNA 组诱导更高水平的细胞因子（IFN‑ γ/TNF‑α/IL2）。

总的来说，基于环状 mRNA 的 anti‑CD19 CAR T 细胞在体外能显著且特异性地杀伤 CD19 阳性靶细胞，且杀伤活性显著高于基于线性 mRNA 的 CAR‑T 细胞。

CAR-T 在小鼠体内的动态变化

小鼠尾静脉注射 CAR‑T 细胞后，线性 CD19-mRNA 组和 CD19-circRNA 组在第 1 天和第 3 天均能在外周血中检测到 CAR‑T 细胞，其中 CD19-circRNA 组检测到的 CAR‑T 细胞占所有 T 细胞的比例为约85％(第 1 天)和约 55％(第 3 天)，显著高于线性 CD19-mRNA 组(第 1 天为约 42％，第 3 天为约 20％)。第 5 天时外周血中检测到 CAR‑T 细胞的含量与空白对照组相当。

该研究结果表明，基于 CD19-circRNA 的 CAR‑T 细胞在小鼠体内的存活时间显著长于基于线性 CD19-mRNA 的 CAR‑T 细胞。

CAT 在小鼠体内的特异杀伤活性

将荧光强度相同的 Nal-6-Luc 小鼠模型分为三组：UTD 空白对照组，低剂量环状组，高剂量环状组。给药治疗方案为：UTD 组每只小鼠注射激活但未转染 CD19‑CAR mRNA 的 3×106 个 T 细胞，低剂量组每只小鼠注射1×106个 cirRNA‑CD19 CAR‑T 细胞，高剂量组每只小鼠注射3×106 个cirRNA‑CD19 CAR‑T 细胞。每 4 天进行一次 CAR‑T 细胞静脉注射给药，共给药三次(给药时间分别为接种 Nal-6-Luc 细胞后第 3 天、第 6 天和第 9 天)。

在第一次给药治疗后，与对照组相比，高剂量组中 Nalm‑6‑luc 细胞的荧光信号明显降低。在 3 次治疗全部结束后，第 10 天、第 17 天、第 24 天和第 31 天的活体荧光成像均显示 CAR‑T 给药组小鼠体内的 Nalm‑6‑luc 细胞显著减少，其中多只小鼠体内完全检测不到荧光信号，提示这些小鼠体内的 Nalm‑6‑luc 细胞已经被全部清除。第 31 天的成像结果显示，尽管离最后一次给药(第 9 天)已经过去了 22 天，cirRNA‑CD19 CAR‑T 细胞仍然能明显清除小鼠体内的 Nalm‑6‑luc 细胞，未出现 CD19 靶细胞复发的情况。

本实验结果证明，基于无疤痕环状 RNA 制备的 CAR‑T 细胞在小鼠体内存活时间更长，能显著杀伤和清除靶细胞，杀伤和清除效果能长时间维持，小鼠体内未见靶细胞重新生长(复发)。

线性组与环状组的 CAR-T 体内杀伤活性

类似的，将荧光强度相同的 Nal-6-Luc 小鼠模型分为三组：UTD 空白对照组，线性组，环状组。给药治疗方案为 UTD 组每只小鼠注射激活但未转染 CD19‑CAR mRNA 的 3×106 个 T 细胞，线性组每只小鼠注射线性3×106CD19-mRNA CAR‑T 细胞，高剂量环状组每只小鼠注射 3×106 个 cirRNA‑CD19 CAR‑T 细胞。此后每隔 5 天 进行一次 CAR‑T 细胞静脉注射给药，共给药四次(给药时间分别为第 3 天、第 8 天、第 13 天和第 18 天）。

与 UTD 对照组相比，线性组显著抑制 Nalm‑6‑luc 细胞的荧光信号，但未观测到对 Nalm‑6‑luc 细胞荧光信号的清除；环状组能显著抑制 Nalm‑6‑luc 细胞的荧光信号，且第 14 天之后实现了对 Nalm‑6‑luc 细胞荧光信号的清除，至实验结束时，环状组未观察到 Nalm‑6‑luc 细胞重新出现(复发)。

小鼠生存时间分析结果显示，环状组小鼠在实验结束时(Nalm‑6‑luc 细胞接种后第 40 天)，均未出现小鼠死亡，而 UTD 组小鼠和线性组小鼠均全部死亡，环状组小鼠生存率显著高于线性组。

在第 12 天，取小鼠外周血检测 CAR‑T 细胞比例，线性组外周血中 CAR-T细胞的比例约为18％，而环状组小鼠外周血中 CAR‑T 细胞的比例约为40％，显著高于线性组。此外，还在第 20 天取外周血检测记忆性 T 细胞比例，使用 CD45RA 和 CD62L 双阳性作为标记，检测到线性组小鼠外周血中记忆性 T 细胞比例约为 5％，而环状组小鼠外周血中记忆性 T 细胞比例约为 33％，显著高于线性组。

基于无痕环状 RNA 的体内 CAR-T 平台

制备 T 细胞靶向性脂质纳米颗粒

CD5-tLNP 转染 T 细胞效果

CD5-tLNP 包封 Luc 转染 T 细胞，转染效率可达到 50%~60%。

CD5-tLNP 递送 CD19-circRNA 生产体内 CAR-T

与对照组相比，tLNP‑CD19‑CAR‑circRNA 给药组中，小鼠体内 Nalm‑6‑luc 细胞荧光强度明显减弱，证明了tLNP‑CD19‑CAR‑cmRNA 能在小鼠体内发挥杀伤 CD19 阳性靶细胞的活性。

小结

元码基于无痕环状 RNA 构建了体外和体内 CAR-T 平台，相较于线性 mRNA，编码 CAR 的环状 RNA 可实现更加持久和高密度的表达，相应地，基于环状 circRNA-CAR 的 T 细胞具有更加持久的杀伤活性。元码采用电转方式在体外制备基于环状 RNA 的 CAR-T 细胞，然后将其注射到血液瘤小鼠模型体内，可完全抑制肿瘤生长，并且长时间维系无肿瘤信号。为搭建体内 CAR-T 平台，元码构建偶联 CD5 抗体分子的脂质纳米颗粒递送系统，能够特异性靶向 T 细胞，在小鼠体内可显著抑制肿瘤生长。根据近期元码的融资公告来看，未来其将重点布局基于环状 RNA 的体内 CAR-T 平台，在 circRNA 生产工艺和靶向性抗体偶联 LNP工艺两个方向做出突破性成果。

参考文献

1. 利用无疤痕环状mRNA工程化改造细胞的方法及其用途，申请公布号119662682 A.

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