Cell Reports | 福建农林大学联合天津大学开发植物新型DNA大片段重组系统，实现DNA大片段高效定向整合

定向整合大片段DNA至植物基因组是合成生物学和植物基因工程领域的急需技术。近年来，研究人员一直在探索一种能够在植物体内敲入大片段DNA的基因组定点编辑技术。但目前植物中的定向整合系统仍存在诸多不足，如CRISPR-Cas9系统会产生DNA双链断裂（DSB），造成基因片段的插入与缺失、染色体碎裂和染色体易位等；由CRISPR-Cas9系统发展而来的引导编辑系统和GRAND编辑系统虽然减少了对DSB的依赖，但均不能在植物基因组插入超过1kb的DNA片段，且编辑效率较低；转座酶基因敲入系统虽然能够在无需DSB的情况下整合DNA大片段到植物基因组中，且不依赖宿主重组，但其整合位点通常为半随机且缺乏拷贝数的控制；另外，经典的酪氨酸重组酶，如Cre和FLP，虽已广泛用于真核生物基因组的改造，但是它们的重组事件通常是可逆的。

近日，福建农林大学联合天津大学在Cell Reports杂志上发表了题为Efficient site-specific integration of kilobase-length DNA fragments in plant cells via Kp03 recombinase的研究论文，报道了利用Kp03大丝氨酸重组酶在植物细胞中进行高效靶向DNA大片段整合的研究。

研究团队首先在植物细胞中利用三质粒系统评估了Kp03大丝氨酸重组酶在质粒水平上的整合能力。在水稻和拟南芥原生质体中，Kp03介导的重组效率分别高达99.1%和94.4%，且该重组酶在植物细胞内的活性不需要额外的辅助因子。

为进一步明确Kp03系统能够整合的最大DNA片段长度，研究团队设计了一系列不同长度的供体DNA,结果表明Kp03可在植物细胞中实现最长达27.3kb的外源DNA片段的高效整合，显著突破了现有技术在整合容量上的限制。另外，为优化重组元件的最小化设计，研究人员系统截短了Kp03 attB序列，发现当其长度缩短至15bp时仍保留一定一定的整合能力。更为重要的是，通过基因序列比对，在水稻基因组序列中找到了一段与Kp03 attB 15bp完全相同的水稻内源序列。在此位点，不需要提前安装Kp03 attB附着垫序列就可将3.4kb外源DNA序列整合到该目标位点中。众所周知，当前位点特异性重组酶与引导编辑器需要联合使用才能在植物中实现kb级大片段的DNA定点插入，但Kp03系统能够通过一步法直接在水稻基因组中实现kb级的外源DNA大片段的整合。不过，Kp03 attB序列长度为15bp时，Kp03的重组能力较低，为了克服这个限制，研究人员通过NM-PE系统在水稻基因组中精准插入了Kp03 attB 26bp序列，构建出可用于整合的底盘细胞，并通过基因枪轰击方法，成功将3.4kb的外源大片段DNA整合至该目标位点，并获得了稳定的转基因水稻材料。

综上所述，研究人员在植物中开发了一种新型的Kp03大片段基因敲入系统，该系统在质粒水平上实现了27kb以上的DNA大片段整合，并通过一步法将外源3.4kb的DNA片段成功整合到水稻原生质体基因组中，此外，该系统与NM-PE系统联合使用，获得了含有3.4kb外源大片段精准插入的水稻植株，实现了植物体内定点大片段整合，为植物合成生物学研究和分子育种提供了强有力的技术支持。

福建农林大学熊延教授课题组的青年教师闫大琦、孟彦彦和张楠为本文的共同第一作者，福建农林大学熊延教授、天津大学温明章教授和福建农林大学朱晓玥教授为本文共同通讯作者。该工作得到了中国农业科学院周焕斌研究员、福建农林大学徐通达教授和刘岩林教授、清华大学陈浩东教授的帮助和大力支持。该研究得到了国家重点研发计划项目、国家自然科学基金、福建省自然科学基金和福建农林大学等的经费资助。

论文链接：

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(25)01279-3