《食品科学》：华南农业大学刘晓娟教授：全反式和顺式虾青素对胰腺α-淀粉酶的抑制效果差异及其机制

虾青素是一种含氧类胡萝卜素，分子结构有一条长共轭双键链，链两端各连接一个含有羟基和酮基的

胰腺

华南农业大学食品学院的邹晓君、郑钦生、刘晓娟*等人旨在探究全反式和顺式虾青素对PPAA的抑制效果及其作用机制。通过酶活性抑制实验、光谱技术和MD技术分析虾青素对PPAA构象的影响、与PPAA的结合位点、荧光猝灭机制、结合常数和热力学参数。研究结果有助于揭示虾青素异构体的降血糖活性差异和潜在机制，对于开发降血糖的新型功能性食品和药品具有重要的应用价值。

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顺式虾青素的制备和鉴定

光碘异构化是实现虾青素顺式转化的有效手段。全反式虾青素光碘顺式转化后，采用HPLC对异构化后产物进行检测，结果如图2A、B所示。异构化后的虾青素含有3 个主要吸收峰，其中2号和3号峰是新产生的。经过乙醇提纯后，2号和3号峰样品相对含量显著增加，分别由23.18%和21.43%上升至24.49%和44.02%。1号峰样品含量下降，附近还出现了其他峰，可能在异构化过程中有其他副产物的形成。根据课题组前期研究结果对这3 个峰的保留时间进行初步判断得出，1号峰样品为全反式虾青素，2号峰样品为9-顺式虾青素，3号峰样品为13-顺式虾青素。

为了进一步明确这些异构体的构型，本研究借鉴经典的Q值计算法判定顺式异构体，Q值是目前公认的一种快速、简便的判定顺式构型的方法。顺式异构体由于其分子结构中双键的弯曲，会在300～400 nm范围内产生一个额外的吸收峰，这个峰称为顺式峰，全反式异构体则只有一个主吸收峰。顺式峰的吸光度与主峰吸光度的比值被定义为Q值，根据Q值大小判断虾青素发生异构的位点。使用HPLC-二极管阵列检测器收集各峰的电子吸收光谱，并据此计算Q值。如图2C所示，1号全反式虾青素峰只在480 nm附近出现一个主峰，2号峰样品除主峰外，还在350～400 nm处出现一个吸收峰（顺式峰），表明2号峰样品是顺式虾青素。此外，相比全反式虾青素下凹的形状，3号峰样品在350～400 nm处表现出一个不明显的峰型。将1～3号峰样品的主峰和顺式峰的响应值进行计算，得到Q值分别为0.11、0.21和0.63。基于Q值越大表明异构化发生在C链中间的概率越大，再结合虾青素异构体的分子结构看，确定1～3号峰样品分别为全反式、9-顺式和13-顺式虾青素。

接着通过硅胶柱层析进行分离纯化。如图3A所示，在过柱分离过程中产生了3 个色带，将它们分开收集，并通过TLC进行初步鉴定。如图3B所示，薄层板上显示含有3 种主要的物质，它们与顺式虾青素混合物（参比）的斑点有很好的对应性，并且3 种物质逐渐被洗脱出来，有较好的分离度。根据点板结果，将1～3号（1号色带）、5～7号（2号色带）、11～18号（3号色带）斑点分别合并后用HPLC鉴定虾青素构型和纯度。如图3C所示，1、2和3号色带分别对应全反式、9-顺式和13-顺式虾青素，并且9-顺式和13-顺式虾青素样品纯度分别达到95.07%和90.87%。由此可见，本研究建立的光碘异构实现了顺式虾青素的快速转化，乙醇提取利用了虾青素顺式和全反式溶解度的显著差异富集顺式构型，硅胶柱层析和薄层层析的优化条件实现了9-顺式和13-顺式的有效分离。高纯度的顺式虾青素为后续研究提供了原料支持。

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全反式和顺式虾青素对PPAA活性的抑制作用

酶活性抑制实验是评估化合物对特定酶功能影响的重要方法，它能够直接观察和量化虾青素异构体对PPAA活性的抑制效果。通过测定不同质量浓度下虾青素几何异构体对PPAA活性的影响，可以评估它们作为天然酶抑制剂的潜力，这对于开发新型降血糖药物和功能性食品具有重要意义。如图4所示，在10.00、15.00 μg/mL和50.00 μg/mL质量浓度下虾青素几何异构体对PPAA都有明显的抑制效果，并且呈现浓度依赖性。当虾青素质量浓度为10.00 μg/mL时，全反式、9-顺式和13-顺式虾青素对PPAA的抑制率分别为9.59%、11.35%和10.95%，其中9-顺式与全反式虾青素具有显著差异（P＜0.05）；当虾青素质量浓度增加到50.00 μg/mL时，它们的抑制率分别达到51.13%、62.57%和61.55%，9-顺式、13-顺式与全反式虾青素均表现出显著差异（P＜0.05）。因此，本实验表明顺式虾青素相比全反式虾青素具有更显著的PPAA抑制效果，这为开发高效降血糖活性成分开辟新思路。

天然活性物异构体尤其是虾青素的功效逐渐成为近些年的研究热点，如陈晓枫发现不同几何构型虾青素抗氧化和延缓衰老活性大小顺序为：9-顺式＞全反式＞13-顺式，研究进一步揭示了其在抗氧化和延缓衰老机制上存在差异；Liu Xuebo等发现顺式虾青素特别是9-顺式异构体在抑制细胞氧化应激和炎症反应方面比全反式虾青素更有效。此外，9-顺式还显示出对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中6-羟基多巴胺诱导的活性氧生成的最有效抑制，以及对虾皮素诱导的II型胶原降解的最有效抑制。由于6-羟基多巴胺诱导的SH-SY5Y细胞模型与帕金森病的病理机制相关，9-顺式虾青素的这种抑制作用可能为帕金森病的治疗提供新的策略。这些研究体现出顺式虾青素介导了更优异的健康效应，然而通过聚焦功能酶的角度来阐明虾青素异构体活性差异机制有待进一步探索。

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全反式和顺式虾青素对PPAA构象的影响

根据抑制剂与酶结合的特点可将抑制类型分为不可逆抑制和可逆抑制两种，其中大多数抑制类型都为可逆性抑制。可逆抑制类型又可分为4 类，分别为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制、混合型抑制。竞争性抑制是指抑制剂在与底物相同的结合位点与酶结合，可逆地阻断底物分子被酶水解；非竞争性抑制则是在与底物不同的结合位点与游离酶或酶-底物复合物结合，破坏酶的构象使其失活；反竞争性抑制中抑制剂仅在底物已经与酶结合后，才能与酶结合，形成酶-底物-抑制剂复合物，阻止产物的形成。混合型抑制则结合了竞争性抑制和非竞争性抑制的特点，既能与游离酶结合也能与酶-底物复合物相互作用。为了探究虾青素异构体抑制PPAA活性的作用机制，首先采用CD和SFES分析相互作用对PPAA构象的影响。

如图5和表1所示，天然PPAA在207 nm处出现一个最低的波谷，通过软件计算得到其二级结构为7.57% α-螺旋、43.40% β-折叠、20.17% β-转角和36.40%无规卷曲，表明PPAA的二级结构主要是β-折叠，这与前人的研究结果一致。当PPAA结合了虾青素几何异构体后，其CD光谱出现波动并发生轻微上升，对二级结构中的β-折叠相对含量产生微弱的影响，其在全反式、9-顺式和13-顺式虾青素中分别提高到43.83%、43.73%和43.87%，它们都不存在显著性差异（P＞0.05）。这种现象表明全反式和顺式虾青素与PPAA的结合不会对蛋白二级结构造成明显改变，有助于PPAA维持其原有的生理功能。

进一步，通过SFES观察虾青素几何异构体是否会对PPAA微环境造成影响，依据光谱中最大发射波长位置的变化反映相互作用对生色氨基酸（Trp、Tyr、Phe）周围环境极性的影响。当激发波长和发射波长的波长间隔∆λ固定为15 nm或60 nm时，可以分别获得酪氨酸（Tyr）或色氨酸（Trp）残基的微环境信息。如图6所示，Tyr和Trp残基分别在296 nm和340 nm处出现最大发射波长。随着全反式、9-顺式和13-顺式虾青素的加入，Trp残基的最大发射波长均发生了微弱的位移（1 nm以内），而对Tyr残基微环境没有影响，表明虾青素几何异构体的结合位点可能位于Trp附近。由此可见，虾青素几何异构体与PPAA的相互作用不会显著影响PPAA的微环境。

CD和SFES的结果表明，虾青素几何异构体与PPAA的相互作用并未引起蛋白质构象的显著变化。考虑到在混合或非竞争性抑制机制中，酶的构象通常会被破坏。并且在无底物淀粉存在的情况下，虾青素几何异构体已经存在与PPAA的相互作用，排除了反竞争性抑制的可能。基于此，推测虾青素几何异构体是通过竞争性抑制机制降低PPAA活性，发挥降血糖效应。这一假设与先前全反式虾青素作为α-葡萄糖苷酶竞争性抑制剂的报道一致。因此接下来对虾青素几何异构体与PPAA的相互作用进行验证，以进一步支持这一假设。

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全反式和顺式虾青素与PPAA的模拟结合

MD是预测和可视化小分子-蛋白质相互作用的重要工具。通常，低于－5 kcal/mol的结合能被认为结合相对稳定。本研究利用MD模拟探索虾青素异构体与PPAA的结合位点，并与PPAA的特异性抑制剂（阿卡波糖）进行对比分析，为PPAA与虾青素异构体的相互作用机制提供更深入的了解，对接结果如图7所示。

如表2所示，PPAA与全反式、9-顺式和13-顺式虾青素的结合自由能分别为－9.3、－10.0 kcal/mol和－9.9 kcal/mol，这些值明显低于－5 kcal/mol阈值，说明结合相对稳定。值得注意的是，9-顺式和13-顺式虾青素的结合自由能小于全反式虾青素，结合自由能越低结合结构越稳定，说明顺式虾青素与PPAA的结合更稳定。此外，不同虾青素几何异构体的主要相互作用力都为范德华力、氢键和疏水作用力，并且均与Glu233残基形成氢键，但顺式虾青素的氢键键长更短，暗示其可能具有更强的氢键作用力。与此同时，顺式虾青素比全反式虾青素具有更多的互作氨基酸残基。这是因为顺式虾青素与全反式虾青素在结构上的关键区别在于分子链的形状，它们分别表现为折叠和直线。折叠的形状使顺式虾青素更充分地利用了酶催化中心的空间，而线性的形状则使全反式虾青素的结构更多地暴露在外面。因此，更多的氨基酸残基将参与顺式虾青素的相互作用，这一结论在虾青素与牛血清白蛋白的相互作用中也得到了印证。此外，Trp59残基都参与了虾青素几何异构体与PPAA的相互作用，这可以解释2.3节中Trp最大发射波长的轻微位移变化。

最优的对接模式显示虾青素几何异构体都结合在PPAA的催化中心（图7），并且结合位点较为相似。已知Asp197、Glu233和Asp300是酶催化中心的关键氨基酸残基，它们都存在于虾青素几何异构体的互作氨基酸残基中。进一步对比虾青素几何异构体和阿卡波糖的结合位点（图7D），可以发现它们的结合位点十分相似。虾青素作为脂溶性物质，由于具有“极性-非极性-极性”的线性结构，其与酶的结合过程可能是通过疏水相互作用扩散到酶分子内部的疏水腔中，并通过极性含氧基团（羟基和酮基）与酶的氨基酸残基形成氢键。阿卡波糖作为水溶性物质，则通过羟基与酶活性中心内氨基酸残基的极性基团形成氢键。因此，这可能解释了二者与PPAA结合位点相似的现象。由于阿卡波糖可以竞争性地结合酶的催化中心进而起到抑制酶活性的作用，这在理论层面进一步证明虾青素几何异构体具有抑制PPAA活性的作用，并且抑制机理是竞争性结合酶的催化中心抑制酶活性，这一机理在其他的研究中也得到了印证。近期有研究表明，当卵黄高磷蛋白质量浓度高于1 mg/mL时对PPAA的抑制作用为竞争性抑制，其通过结合在PPAA的活性空腔中，竞争性结合底物的催化位点，进而降低PPAA活性。另有报道3 种黄酮类化合物芦丁、槲皮素和山柰酚通过占据PPAA的主要活性位点，竞争性地阻碍底物进入，导致酶的催化活性降低。

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全反式和顺式虾青素与PPAA相互作用的荧光猝灭机制

荧光猝灭效应分析可用于观察虾青素与α-淀粉酶分子间结合的相互作用。PPAA内部含有17 个Trp残基，由于Trp、Tyr和苯丙氨酸（Phe）等芳香族氨基酸存在，PPAA具有内源性荧光，荧光的强度和位置与这些芳香族氨基酸残基所处的微环境密切相关。由于荧光团对周围环境的极性很敏感，因此可通过IFES测定分子间相互作用信息。

如图8所示，在加入虾青素几何异构体后，334 nm处的荧光发射峰明显下降，并且表现出浓度依赖的猝灭效果，这表明虾青素几何异构体与PPAA发生相互作用导致蛋白荧光猝灭。与此同时，位于280 nm处的肽链荧光峰也随着虾青素质量浓度的增加而增强，表明二者的相互作用影响了蛋白质结构，但由于其最大发射波长没有出现位移变化，因此推断这种影响比较轻微，该结果与CD和SFES检测效果吻合。

为了进一步阐明虾青素几何异构体和PPAA的荧光猝灭机制，采用Stern-Volmer方程（式（4））进行计算分析。如图9所示，在不同温度（298、310 K）条件下，荧光强度比（F0/F）与虾青素几何异构体质量浓度（[Q]）之间均呈现良好的线性关系，且决定系数R2值接近1，说明虾青素几何异构体猝灭α-淀粉酶的荧光过程中存在单一的猝灭机制。

据报道，荧光猝灭机制可分为静态猝灭和动态猝灭以及两者的结合。静态猝灭涉及猝灭剂和荧光分子之间形成复合物。由于复合物在较高温度下稳定性降低，所以Ksv随温度升高而降低。动态猝灭则是猝灭剂与荧光团扩散和碰撞的结果。由于扩散和碰撞事件的加剧，所以Ksv随着温度的升高而增大。由表3可以看出，全反式、9-顺式和13-顺式虾青素的Ksv都随着温度升高而下降，且同种虾青素（不同温度）对α-淀粉酶的Ksv值与温度之间呈显著负相关（P＜0.05），上述结果表明虾青素几何异构体与PPAA发生结合时猝灭机制为静态猝灭而不是动态猝灭。此外，3 种虾青素异构体的双分子猝灭速率常数Kq都远高于生物分子的最大散射碰撞猝灭常数2.0×1010 L/（mol·s），再一次支持静态猝灭机制的结果。这一现象与没食子酸对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭过程为静态荧光猝灭，而不是由分子碰撞引起的动态荧光猝灭类似。

综上所述，荧光猝灭研究表明虾青素几何异构体与PPAA的相互作用引起了轻微的蛋白质结构变化，并且荧光猝灭机制为静态猝灭。将对荧光强度进一步计算，通过分析结合常数和热力学参数，进一步探究虾青素几何异构体与PPAA的相互作用中的结合模式和亲和力，以深入揭示虾青素异构体降血糖活性差异背后的分子机制。

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全反式和顺式虾青素与PPAA相互作用的结合常数和结合位点数

2.3节已经证明虾青素异构体可以作为PPAA的抑制剂，并且发现虾青素异构体表现出不同程度的抑制效果。为了探究它们作用差异的可能因素，使用双对数方程（式（5））利用2.5节荧光强度进行计算，结果如图10所示，按照线性截距和斜率分别代表结合常数KA和结合位点数量n进一步分析。

虾青素几何异构体表现出不同程度的结合亲和力。在298 K时，9-顺式和13-顺式虾青素具有较高且相近的结合常数（KA），分别为1.24×103 L/mol和1.35×103 L/mol，全反式虾青素表现出最弱的结合常数，为6.05×102 L/mol，并且顺式虾青素与全反式虾青素之间有显著差异（P＜0.05，表4），表明顺式虾青素较全反式虾青素对PPAA具有更强的结合亲和力。这种结合亲和力强弱的趋势与酶活性抑制效果一致。李志鹏等研究2 种青稞多糖对PPAA的抑制作用和徐冬兰等研究苦丁冬青苦丁茶咖啡酰奎尼酸类物质与PPAA的抑制作用也得到了相似的结果。此外，虾青素-PPAA的n接近于1，表明虾青素几何异构体在PPAA中均只有一个结合位点。

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全反式和顺式虾青素与PPAA相互作用的热力学参数和相互作用力

热力学参数也是反映分子间相互作用的一个重要指标，虾青素几何异构体与PPAA结合模式的不同会导致它们在热力学参数上表现出差异。此外，热力学参数还是推断相互作用力的重要依据，这有助于进一步了解它们的结合机制。因此使用式（6）、（7）分析2.5节中IFES的相互作用力。

Ross等根据大量实验总结了水相中小分子与生物大分子结合的热力学参数与主要作用力之间的关系：1）当ΔH＞0、ΔS＞0时，两者间为疏水作用力；2）当ΔH＜0、ΔS＜0时，则为氢键和范德华力；3）当ΔH≈0、ΔS＞0，则为静电引力。如表5所示，全反式、9-顺式和13-顺式虾青素与PPAA相互作用的焓变∆H分别为－70.02、－67.54 kJ/mol和－105.33 kJ/mol，熵变∆S分别为－181.71、－167.43、－293.56 J/（moL·K）。虾青素几何异构体均呈现负值的∆H和∆S，表明驱使它们与PPAA发生结合的主要相互作用力是氢键和范德华力，这与MD所揭示的相互作用力类型高度一致。同时，13-顺式虾青素的∆H和∆S均小于全反式和9-顺式虾青素，它们热力学参数的差异暗示13-顺式虾青素可能与更多的氨基酸残基相互作用或具有更强的相互作用力，这也与MD中顺式虾青素比全反式虾青素结合更稳定的结果相呼应。此外，结合过程中的ΔG小于0，表明虾青素几何异构体与α-淀粉酶之间的相互作用是自发进行的。并且，焓变对ΔG的负值起到了主要贡献作用，说明该反应由焓驱动。

热力学分析和MD的结果一致表明，虾青素几何异构体与PPAA之间的主要相互作用力为氢键和范德华力。与虾青素不同的是，其他类胡萝卜素如β-胡萝卜素和番茄红素与蛋白质的相互作用主要表现为疏水相互作用，因为它们的分子结构中缺乏含氧基团，阻碍了氢键的形成。虾青素几何异构体相同类型的相互作用力可归因于它们相同的官能团，这表明虾青素与PPAA相互作用力的形式不受异构体结构差异的影响。类似地，有学者通过热力学分析得出，顺式和反式Pt(NH3)2Cl2共轭物与壳聚糖纳米颗粒的作用力类型均为亲水和疏水作用。这一现象表明顺反异构体虽有结构差异，但相互作用力类型可能不变，与本研究发现相契合。

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结 论

本实验探讨了虾青素异构体对降血糖关键调控酶的抑制效果，通过光谱技术和MD技术从全反式和顺式虾青素与PPAA的结合力和结合模式角度，揭示了其抑制酶活能力的差异及其分子机制。顺式虾青素抑制PPAA活性能力显著优于全反式构型，暗示其具有更强的降血糖活性。虾青素异构体与PPAA的相互作用未对蛋白质构象带来明显改变，有助于PPAA维持其原有的生理功能。虾青素异构体的结合位点均位于PPAA的催化口袋，与酶抑制剂阿卡波糖的结合位点相同，并且与酶催化中心的关键氨基酸残基Asp197、Glu233和Asp300具有相互作用，表明虾青素异构体对PPAA的抑制均为竞争性抑制。同时，虾青素异构体与PPAA发生结合均为静态猝灭。进一步揭示了不同虾青素几何异构体的主要相互作用力都为范德华力、氢键和疏水作用力，并且均与Glu233残基形成氢键，但顺式虾青素的氢键键长更短，表明其具有更强的氢键作用力。与此同时，顺式虾青素比全反式虾青素具有更高的结合亲和力、更多的相互作用氨基酸残基和更低的热力学参数，再次表明其与PPAA具有更强的结合能力，使得顺式虾青素比全反式虾青素具有更强的酶活性抑制效果。这些研究结果揭示了全反式和顺式虾青素对PPAA活性抑制能力的差异及其分子机制，不仅有助于探索虾青素在调节血糖水平方面的应用潜力，而且对于理解虾青素异构体活性差异的分子机制具有重要意义。后续还需进一步通过体内动物实验和人体实验来进一步揭示全反式和顺式虾青素的降血糖功效差异及其原因，以期为开发降血糖的新型功能性食品和药品提供重要线索。

作者简介

通信作者：

刘晓娟，华南农业大学食品学院副教授。2008年博士毕业于暨南大学。2015年7月至2016年7月，国家公派到美国马萨诸塞州立大学（全美博士学科点食品排名第一）做访问学者一年，主要从事食品功能因子活性评价及作用机理、食品生物化学与分子生物学、递送体系提高活性物的生物利用率、功能食品研发等领域的研究工作。广东省高等学校“千百十工程”校级培养对象，华南农业大学2020年“三育人”教书育人先进个人、华南农业大学“第一批卓越青年教师百人计划、”华南农业大学“青年骨干教师”，广东省企业科技特派员、农村科技特派员。在教学方面，系统讲授《食品化学》、《功能食品学》等课程，负责省级一流（课程思政）本科课程；在科研方面，近年来，主持2项国家自然科学基金项目、1 项教育部博士点基金项目、4 项广东省自然科学基金项目、1 项广东省科技计划项目、1 项广州市重点研发项目、1 项广州市科技计划项目、1 项广东省教育厅项目、5 项企业横向课题等十多个项目，主要参与国家级、省市级各类项目30多项；以第一作者和通讯作者发表论文40多篇，其中SCI&EI收录30多篇；申请国家发明专利6 项。

第一作者：

邹晓君，华南农业大学在读硕士研究生，研究方向为食品化学及功能性食品。

本文《全反式和顺式虾青素对胰腺α-淀粉酶的抑制效果差异及其机制》来源于《食品科学》2025年46卷第15期35-46页，作者：邹晓君，郑钦生，赵凯欣，冯裕杰，肖 杰，贺丽苹，曹 庸，刘晓娟*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250102-007.。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：闫凯；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网