FSHW | 选定的益生菌组合在模拟的面筋和小麦面包消化过程中的代谢特征

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Abstract

益生菌在胃肠道环境中进行代谢活动，通过提高免疫力、治疗代谢紊乱、调节微生物群和代谢组来影响宿主的健康。由于谷蛋白相关疾病的高发病率，本研究旨在深入探讨两种选定的微生物群（MCs）在模拟胃肠道条件下谷蛋白消化过程中的代谢。这两种MCs以高蛋白酶和肽酶活性为特征，涉及与两种商业蛋白酶酶结合的不同乳酸菌和芽孢杆菌株。面筋底物被用作纯化提取物、白面包和全麦面包。相反，对照样品依赖于微生物酶的缺乏。24 h的模拟消化足以完全水解两个含有MCs的实验组中的谷蛋白，并且48 h消化的提取物没有改变乳糜泻（CeD）患者十二指肠活检中的细胞因子表达。当检测消化样品的抗氧化和植酸酶活性时，微生物酶显著提高了ABTS和DPPH的清除活性，并降低植酸浓度。通过检查游离氨基酸谱可以区分这两个MCs，而检测异质性挥发性有机化合物组分支持微生物酶的存在/活性，而MC之间没有统计学显著差异。作为功能贡献，含有MCs的消化提取物还被证明可以降低暴露于脂多糖触发物的细胞系中的炎性细胞因子浓度。因此，与探索新型辅助疗法的研究一致，目前以高谷蛋白水解代谢为特征的创新益生菌联盟也显示出改善受谷蛋白相关疾病或CeD患者通常会改变的各种参数的能力。

Introduction

益生菌作为酶源对由于缺乏特定酶而不能被宿主直接消化的底物的有效性。因此，益生菌可以作为辅助疗法被利用，它们在肠道中的活动可以减缓许多由大规模发病引起的病理的进展，包括肥胖、糖尿病、肠易激疾病（IBD）、非酒精性脂肪肝和肾病。在易感患者中，益生菌还可以减少因不耐受引起的副作用，包括广泛的基于面筋的疾病，即乳糜泻（CeD）、小麦依赖性运动诱发的过敏反应、呼吸道过敏、非乳糜泻面筋敏感性和面筋依赖性肠易激综合症。

无论病因和面筋敏感程度如何，无面筋饮食（GFD）是用于对抗乳糜泻不良症状的独特疗法。然而，尽管遵循GFD，患者的健康仍然受到食物交叉污染和家庭的饮食习惯的损害。以及声称无面筋的食品，这些食品实际上超过了20×10-6的安全限值。此外，由于GFD提供的谷物摄入量减少，以及由此导致的微营养素和纤维营养不足，不能建议将无面筋饮食视为平衡的饮食模式，从而导致营养不良相关疾病的风险增加。

因此，考虑到在非乳糜泻面筋敏感性中不完全面筋剥夺的重要性，最合适的方法之一是通过口服应用酶或表达酶的益生菌来改善患者的消化。由于与面筋表位释放相关的潜在风险，益生菌途径已被公认为是具有高度治疗潜力和针对宿主生理功能的多种功能的高影响力的吸引策略。虽然对宿主状态的整体贡献尚未评估，但先前的研究表明，通过施用活益生菌或酶提取物可以改善非乳糜性面筋敏感患者的肠道微生态。

此外，由于谷蛋白中脯氨酸的含量较高，且宿主无法合成脯氨酸蛋白酶，富含脯氨酸的谷蛋白片段会到达小肠。最近的文献探索了创新配方，有助于消化谷蛋白及其免疫毒性衍生物。事实上，在细菌、真菌和植物界中，蛋白酶和靶向脯氨酸的蛋白酶非常普遍。在模拟消化系统中，黑曲霉的脯氨酰内切酶能够将谷蛋白高效代谢成非免疫原性肽。并在体内观察到了有希望的结果。考虑到至少需要5种蛋白酶才能完全水解谷蛋白及其免疫毒性表位。在前面的工作中，组装了一个微生物共生体（MC），即MC16，其特点是蛋白酶和肽酶的互补活性。通过细致的步骤选择，可以获得能够在不到24 h内水解0.5 g面筋的MC。在设置体内试验之前，这里进行的实验设计旨在使用两种不同的商业酶来改善MC16对面筋水解的代谢，这些酶有助于消化20倍增加的面筋量。

本研究文章还旨在验证MC16的整体代谢，扩展对互补功能应用的评估，以改善宿主健康。本研究广泛检查了MC16的代谢，并将其结果与先前组装的具有中间蛋白水解活性的MC12的结果进行了比较。两种MCs中都含有活性的乳酸菌（LAB）、芽孢杆菌菌株和它们的细胞质提取物。除了微生物酶，两种不同的商业酶也被添加到两种MCs中（MC12和MC16）并在模拟的人类胃肠道条件下进行测试。因此，对消化提取物的残留面筋含量、清除活性、抗营养因子、代谢组学（游离氨基酸（FAAs）和挥发性有机化合物（VOC））、免疫毒性和抗炎活性进行了测定。

Result

在模拟的胃肠道条件下，对两种具有不同蛋白水解活性的MCs的谷蛋白代谢进行了检查。MC12和MC16之前已经组装并测试了5 g白面包的谷蛋白水解能力。与测试的其他共生体（MC16）相比，MC12只观察到部分水解，而MC16能够在相同的48 h模拟消化时间内完全水解麦胶蛋白。

清除活性

基于ABTS和DPPH测试，通过48 h消化样品的水提取物的清除活性进行评估（图1A）。与不含MCs的样品相比，ABTS和DPPH测试均支持微生物在增加抗氧化活性平均值方面的巨大贡献。MC12和MC16的最高清除活性在CWB消化期间被发现，实际上，ABTS和DPPH测试显示值高于3.5 μmol/mL。值得注意的是，即使在消化CG和CB的实验组中，与不含微生物酶的样品相比，MCs也增加了清除活性。

抗氧化剂的测定也进行在LAB和芽孢杆菌菌株纯培养物上。总体而言，纯培养物的提取物显示出比消化样品中更高的清除活性值（图1B）。然而，当以类似于整个MC12和MC16活性的方式加权单个贡献时，MC12和MC16之间不存在差异。

图1 （A）消化对照样品的水提取物中商业酶和含有活细胞和裂解细胞的实验样品（MC12和MC16）以及商业酶的清除活性条形图；（B）MC12和MC16中包含的菌株纯培养物水提取物中抗氧化活性的条形图

植酸代谢和植酸酶活性测定

在消化样品中，植酸酶活性和植酸之间存在反相关性（图2A）。在对照样品中（即使含有商业酶）未检测到植酸酶活性，12个含MC样品中有3个（CG-Tolerase-MC12、CG-Tolerase-MC16和CWB-Tolerase-MC12）也表现出无活性。CG-Promod-MC12表现出最高的植酸酶活性（（1.50±0.04）U），而CWB和CWB-Promod表现出最高的植酸值（分别为0.38和0.41 g/100 g）。

LAB和芽孢杆菌菌株MC12和MC16的植物酶活性进行了单独测定（图2B）。结果显示，从（0.76±0.04）U（在戊糖片球菌DSM33371中测定）到（5.56±0.03）U（在短小芽孢杆菌DSM33355中测定）不等。此外，当检查副干酪乳杆菌DSM33373的提取物（（4.64±0.07）U）和短小芽孢杆菌DSM33297的提取物（（4.42±0.02）U）时，评估了高植物酶活性。

通过将纯培养物中单独测定的植酸酶活性值相加，属于MC16的菌株显示出显著高于MC12的值（（22.84±0.47）、（16.83±0.52）U）。

图2 （A）消化对照样品的水提取物的植酸酶活性和植酸测定的条形图；（B）在MC12和MC16中所含菌株的纯培养水提取物中测量的植酸酶活性条形图

氨基酸代谢

在氨基酸代谢方面，48 h消化的样品被用于分析FAA和氨的浓度。平均总FAA为3372.43 mg/kg，范围在CB-Promod中为2357.02 mg/kg，在CG-Tolerase-MC12中为6298.70 mg/kg。氨的平均值为327.98 mg/kg，范围在CBPromod-MC16中为218.47 mg/kg，在CG-tolerase-MC12中为449.76 mg/kg。

在解释变异分布时，基于PCA的多变量分析揭示了包括MC16-含样品的明显聚类，由PC1和PC2的负值支持（图3A）。相反，除了CG-Promod-MC12，负的PC1分数与正的PC2分数影响了MC12-含样品的放置。相反，正的PC1分数导致对照样品重叠。变量矢量负载图（图3B）和变量聚类（图3C）对FAAs（和氨）进行了加权，分为两个不同的聚类，在图3C中标记为“a”和“b”。聚类-a包括那些在对照样品中标记为具有高Z得分的化合物-无论是否添加商业酶-而聚类-b与含有MC12和MC16的消化样品中具有高Z得分的化合物有关。对聚类-b进行子分类，子集群-b1由于高浓度的Asp、GABA、Lys、Gly和Orn而区分了由MC16消化的样品，而其他样品则不同，而子集群-b2包括所有那些由MCs和对照样品中高释放的FAAs。

图3 基于消化控制样品或100 g白小麦和全麦面包的面团，添加或不添加两种商业酶的FAA和氨值的PCA（A）得分；（B）载荷图；（C）热图

VOC代谢

在所有样本中，GC-MS代谢组学共收集了79种属于不同化学类别的VOC，具体包括醇（5种）、醛（7种）、酯（37种）、烃（6种）、吲哚（1种）、酮（4种）、有机酸（7种）、酚（4种）、萜类（2种）和“其他”化学类别（6种）。根据每种化学类别的相对浓度，PCA解释的样品方差分别为35.7%和19.2%，分别对应于第一（PC1）和第二（PC2）成分。负的PC1值导致对照样本的聚类，即不含MC的样本（图4）。相反，含MC的样本显示PC1的正值。PC2对聚类的贡献信息较少。

图4 VOC的PCA图

通过进行层次聚类分析，进一步探索了挥发性支链氨基酸和芳香族氨基酸（分别简称为BCAAs和ArAAs）衍生物以及GC-MS检测的有机酸。相关的热图有助于直观地将样品分配到三个不同的集群（CL1、CL2和CL3）中，而变量（即代谢物）主要分配到两个组（Group-1和Group-2，图5）。Group-1包括氨基酸代谢产生的挥发性醇和酯，而Group-2包括所有挥发性有机酸。Group-1代谢物的子集群，即Group-1a和Group-1b，对于区分CL1和CL2样品非常有帮助。查看Z分数，CL1的特征是高值的2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、丁酸3-甲基丁基酯和苯酚，而CL2表现出高Z分数的ArAA衍生物（苯乙基醇）和BCAA衍生物（3-甲基-1-丁醇乙酸酯）。值得注意的是，苯乙基醇是BCAA衍生物中最具代表性的挥发性有机化合物，其代谢主要依赖于MC16与ToleraseG的组合。Group-2代谢物的Z分数较高，允许定义CL3。

图5 消化样品中VOCs的归一化相对浓度（Z分数）的热图

为了专门检查SCFA的代谢，组成MC12和/或MC16的每种菌株都在补充菊粉或低聚果糖的培养基中进行了发酵测试。乙酸是主要的合成SCFA（图6），平均而言，LAB合成的乙酸和丙酸比杆菌菌株的含量更高，相反，杆菌菌株产生异戊酸的程度更高。在丁酸和异丁酸代谢方面，未检测到LAB和杆菌菌株之间存在显著差异。

图6 在低葡萄糖肉汤培养基中，使用MC12和/或MC16中使用的单菌株纯培养物代谢的SCFA绝对浓度（乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸）的Δ值

体外评估CeD活检的免疫激活

为了评估来自CG、CB和CWB的消化样品是否能诱导CeD患者十二指肠活检标本的免疫激活，提取了麦胶蛋白和谷蛋白多肽。使用qPCR和ELISA分别在mRNA和蛋白质水平上定量了IL-2、IL-10和IFN-γ。正如预期的那样，与不含商业酶的控制样品（RPMI1640+胃和肠液，标记为NegCNT）相比，与不含商业酶的控制样品相比，与不含商业酶的控制样品的浓度显著降低（CG、CB和CWB），以及仅含有商业酶的控制样品（图7）。由于存在来自MC12和MC16的微生物酶，因此显著降低了促炎细胞因子的浓度。由于与NegCNT相比没有差异（P＞0.05），只有含有MC16酶的样品被证明可以避免细胞因子表达，几乎完全避免。

图7 在十二指肠活检标本中IFN-γ、IL-2和IL-10的浓度

体外评估抗炎效果

为了更深入地了解巨噬细胞对小鼠BMDCs炎症的功能作用，测定了暴露于大肠杆菌LPS的细胞上清液中的细胞因子浓度。在基础培养基（RPMI）中孵育的细胞用作阴性对照，其细胞因子浓度为（229.0±36.6）、（10.0±2.0）和（10.0±0.1）pg/mL，分别对应于TNF-α、IL-6和IL-1β（图8）。相反，阳性对照是向RPMI中加入LPS，导致细胞因子浓度显著增加（P＜0.05），即（6008.2±361.2）、（8450±760.5）和（690.3±82.8）pg/mL，分别对应TNF-α、IL-6和IL-1β。在评估巨噬细胞功能活性提供的差异之前，所有消化后的实验样品都进行了测试，以确定其在不添加LPS的情况下直接激活细胞细胞因子分泌的作用。与相对阴性对照相比，这些值没有显著增加。

图8 TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β（C）的细胞因子浓度

MC消化提取物的功能评估是基于细胞因子浓度与同时含有LPS和槲皮素的样本（RPMI+LPS+AOx）的比较。

TNF-α在CG+MC12+Promod+LPS（图8A）中的例外情况，所有用2种MC之一消化后的实验样品与RPMI+LPS+AOx样品相比没有显著差异。

对于IL-6（图8B），显著差异强调了所用商业酶的贡献。更详细地说，当Promod与MC结合时，只有CWB+MC16+Promod+LPS与RPMI+LPS+AOx样品没有报告显著差异。当使用耐受酶时，所有含MC16的样品与RPMI+LPS+AOx样品没有表现出显著差异，而两个含MC12的样品（即CB+MC12+耐受酶+LPS、CWB+MC12+耐受酶+LPS）显示出统计学上的显著差异。

对于IL-1β（图8C），所有含有Tolerase+MC12的样品显示与RPMI+LPS+AOx相比具有显著更高的浓度。相反，所有含有Tolerase+MC16的样品均未报告IL-1β浓度的增加。尽管将商业酶替换为Promod，但与MC16的组合并未导致显著差异。相反，CG+MC12+Promod+LPS样品与RPMI+LPS+AOx相比具有显著更高的IL-1β浓度。

Conclusion

本研究深入剖析了先前组装的微生物群落，并添加了谷蛋白水解酶进行测试。无论使用哪种商业补充酶，尽管谷蛋白增加了20倍，但在不到24 h内，其代谢浓度降至低于20×10-6。具有适合代谢这种谷物蛋白及其衍生物的微生物完成了这项工作。此外，在白色和全麦面包中观察到微生物群落具有高的抗氧化、植酸和抗炎活性。营养是促进健康和减少药物使用的最佳驱动力。考虑到这一点，本研究设计了一个实验方案，并进行了多次分析，最终确定了能够改善与谷蛋白相关疾病相关生化指标的MC16微生物群落的特征。因此，整体体外证明的贡献为体内挑战性试验铺平了道路。

Metabolic characterization of selected probiotic consortia during gluten and wheat bread simulated digestion

Mirco Vaccaa,1, Giuseppe Celanoa,1, Olga Nikoloudakib, Bodo Speckmannc, Francesco Maria Calabresea,*, Marco Gobbettib, Maria de Angelisa

a Department of Soil Plant and Food Sciences, University of Bari Aldo Moro, Bari 70126, Italy

b Faculty of Science and Technology, Free University of Bozen, Bolzano 39100, Italy

c Evonik Operations GmbH, Hanau-Wolfgang 63457, Germany

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

While exerting their metabolic activities in the gastrointestinal milieu, probiotics impact the host well-being by boosting immunity, treating metabolic disorders, and modulating microbiota and metabolome. Due to the high incidence of gluten-based disorders, the present work aims to deeply explore the metabolism of two selected microbial consortia (MCs) during gluten digestion under simulated gastrointestinal conditions. Featured by high protease and peptidase activity, both MCs accounted for different lactic acid bacteria and Bacillus strains that were combined with two commercial protease enzymes. Gluten substrates were used as purified extracts, white and whole wheat breads. Control samples, instead, relied onto the microbial enzyme lack. Twenty-four hours of simulated digestion were sufficient to completely hydrolyze gluten in one of the two MC-containing experimental sets, and the relative 48 h-digested extract did not alter the cytokine expression in duodenal biopsies from celiac disease (CeD) patients. When digested samples were assayed for antioxidant and phytase activities, microbial enzymes demonstrated to significantly improve both 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) scavenging activity and to decrease the phytic acid concentration. The inspection of the free amino acid profiles allowed for distinguishing the two MCs, whereas the detection of a heterogeneous panel of volatile organic compounds supported the presence/activity of microbial enzymes without statistically significant differences between MCs. As functional contribution, digested extracts with MCs also proved to reduce the inflammatory cytokine concentrations in cell lines exposed to lipopolysaccharide trigger. Therefore, in line with studies exploring novel adjuvant therapies, the present innovative probiotic consortium featured by high gluten-hydrolyzing metabolism also showed the capability to improve various parameters usually found to be altered in patients affected by gluten-based disorders or CeD.

Reference:

VACCA M, CELANO G, NIKOLOUDAKI O, et al. Metabolic characterization of selected probiotic consortia during gluten and wheat bread simulated digestion[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(2): 9250033. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250033.

翻译： 罗敬（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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