《食品科学》：西南民族大学朱成林副教授等：牛肉酸肉发酵过程中特征风味物质与微生物群落组成的相关性

酸肉是以新鲜畜禽肉为原料，通过自然发酵而成的特色风味发酵肉制品，其主要产地为四川、贵州、湖南、云南等西南地区，因其风味独特、游离氨基酸和活性肽丰富且具有较长保质期等特点，深受人们喜爱。

发酵肉制品的风味与发酵过程中微生物群落的演替密切相关。发酵微生物主要来自原料及环境中的微生物。目前大多数对酸肉的研究主要集中在微生物菌群组成解析和风味分析等方面。并且目前研究结果表明，发酵能够有效促进有益微生物的生长繁殖，对提高产品品质具有重要作用，但酸肉发酵过程中微生物群落演替和特征风味物质产生机制的相关研究还比较有限，仍需进一步深入探究。在酸肉发酵中，当前大多数研究是以猪肉为原料发酵酸肉。然而，作为消费量仅次于猪肉和鸡肉的第三大肉类，牛肉发酵制品通常具有更浓郁的肉香和醇厚的口感。

基于此，西南民族大学药学与食品学院的唐钰婷、周秉德、朱成林*等以牛肉为原料发酵酸肉，采用电子鼻、电子舌以及气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）技术测定牛肉酸肉发酵过程中的挥发性风味物质，并利用高通量测序技术测定牛肉酸肉发酵过程微生物菌群变化，进而探讨其与风味物质的相关性，旨在为牛肉酸肉微生物群落结构及挥发性物质差异提供理论依据和数据支持，为发酵酸肉产品品质提升和大规模工业化生产提供参考。

1 电子鼻分析结果

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种多元统计分析方法，具有能够确定复杂、难以找到的变量的优点，可以用来评价不同样品间的差异性。通过对PCA得分和载荷值找到相关的物质，各样品的挥发性有机物数据是在相似信息的基础上进行收集和分类。由图2可知，PC1贡献率达到79.9%，可以很好地反映样品的整体信息。将不同传感器对应的参考化合物进行化合物风味特征比较。由图2a可知，在PC1维度上，不同发酵时间的酸肉呈现依次分布，酸肉的风味在持续变化。具体来看，T0组与T15、T30和T45组发酵酸肉之间距离较远，说明通过发酵改变了牛肉的风味。随着发酵时间的延长，LY2/LG、T40/1、T40/2、TA/2传感器的响应值增加，而T30/1、PA/2、LY2/Gh、LY2/G、P10/1、LY2/AA、T70/2传感器的响应值降低，见图2b。电子鼻可以有效区分不同发酵阶段的酸肉样品。

2 电子舌分析结果

由图3可知，PC1贡献率高达98.6%，所占权重大；所用传感器包括酸味（AHS）、鲜味（NMS）、咸味（CTS）、甜味（ANS）、苦味（SCS）和两个参比电极（PKS和CPS）。根据电子舌PCA图（图3a）可知，牛肉酸肉在不同发酵阶段滋味有明显的区分。由图3b可知，随着发酵时间的延长，NMS、ANS、AHS传感器的响应值增加，而CPS、PKS、SCS、CTS传感器的响应值降低。T45组与T0、T15和T30组发酵酸肉之间距离较远，说明T45组酸肉的滋味与其他组的滋味特征有很大差异。这可能是因为在发酵后期pH值下降，酸肉中滋味物质组成发生变化。

3 GC-IMS分析

图4a为GC-IMS生成的三维谱图，每一个挥发性化合物代表一个点，颜色深浅代表信号强度，从中可以直观地看出不同时期牛肉酸肉发酵过程中挥发性物质峰强度有一定的变化。由于在三维谱图所表现出的各时期的样品的挥发性物质肉眼难以直接进行差异比较，因此本研究进行了降维处理，生成了图4b二维平面差异谱图。选择T0组作为参考，扣除其他谱图中的信号峰。整个谱图背景为蓝色，浓度相同的挥发性物质被抵消为白色，蓝色表示该物质浓度低于参考样品，红色表示该物质浓度高于参考样品，不同颜色的点出现在不同的位置，直观地反映了它们之间挥发性物质的差异，颜色越深表示差异越大。根据红色和蓝色出现的位置和深浅可以看出，4 组样品挥发性风味成分有较大差异。由图4b可知，4 组样品间差异点大多数保留在300～1 200 s之间，相对迁移时间在0.5～1.0 ms之间。

不同时期牛肉酸肉发酵过程中挥发性物质指纹图谱如图4c所示。每行代表一个样品，每列代表一个化合物在不同样品中的含量，化合物含量的高低由颜色的深浅表示。在牛肉酸肉发酵过程中，通过GC-IMS共鉴定出40 种挥发性化合物（包括单体和二聚体），其中醇类13 种、醛类3 种、酸类1 种、酯类12 种、酮类3 种、其他类8 种，具体结果见表2。为了突出显示挥发性风味物质的总体趋势，建立了PCA，如图5所示。

如图5a所示，PCA中PC1贡献率为78.2%，极好地概括了4 组牛肉酸肉之间的差异。载荷图显示了相对含量与PC1维度上重要性之间的相关性，灰色条表示相关性显著（P＜0.05）。其中风味化合物中M表示单体，D表示二聚体。由图5b可知，随着发酵时间延长，酸肉的特征挥发化合物正丁醛、丁酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪M、乙酸乙酯D、β-蒎烯M、乙酸甲酯、2-丁醇、2-甲基丁酸乙酯M、醋酸、2-庚醇、2,6-二甲基吡嗪D、3-甲基丁酸乙酯M响应值显著（P＜0.05）。酯类化合物主要由短链酸和醇在乙酰转移酶或酯酶存在下的相互作用产生，被认为是发酵肉制品风味的关键贡献者。PCA结果显示，与T0组相比，T45组的丁酸甲酯、乙酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯M等酯类物质的响应值显著，为酸肉贡献更多的苹果香、甜香。同时乙酸乙酯具有强烈的果味和低阈值，有助于掩盖不愉快的味道。2-丁醇是一种增味物质，该物质可以通过氨基酸代谢的丙酮酸衍生而来，具有独特的甜香，赋予酸肉特殊香味。

如图6所示，T40/1和TA/2与正丁醛、2-甲基丁酸乙酯M、2-丁醇、3-甲基丁酸乙酯M、乙酸甲酯、丁酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪M、醋酸、乙酸乙酯D、2,6-二甲基吡嗪D和2-庚醇呈正相关，与异丁醇M、正丁醇M、正己醇M呈负相关。T40/2与β-蒎烯M、2-甲基丁酸乙酯M、2-丁醇、3-甲基丁酸乙酯M、乙酸甲酯、丁酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪M、醋酸、乙酸乙酯D、2,6-二甲基吡嗪D和2-庚醇呈正相关，与异戊醇M、异丁醇M、正丁醇M、正己醇M呈负相关。正丁醛、丁酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪M等化合物在T45组酸肉中传感器响应值较高。结果表明电子鼻传感器响应值和GC-IMS挥发性化合物定量表征可以区分不同发酵时间段酸肉的独特风味。

4 牛肉酸肉发酵过程中微生物菌群组成分析

4.1

基于ASV丰度表计算细菌α多样性（ACE、Chao、Shannon和Simpson指数）。ACE指数、Chao指数和Sobs指数用于评价样品中微生物菌群丰富度。Simpson指数和Shannon指数用于表征微生物菌群多样性，Shannon指数越大，表示微生物菌群多样性越高，Simpson指数则与之相反。为了反映不同分组间差异程度，使用单因素方差分析，对α多样性指数进行显著性检验，结果以箱线图表示。为直观展示不同发酵时间段酸肉的微生物多样性的变化，分别对T0、T15、T30、T45酸肉进行α多样性指数分析，结果如图7所示。细菌群落的Coverage大于0.99，表明在酸肉样品中能够观察到大多数的微生物。T0中的ACE、Sobs、Chao指数和Shannon指数与T15、T30、T45组具有显著差异，发酵T0的酸肉中的ACE、Chao、Sobs指数和Shannon指数均远高于其他组，表明随着发酵时间延长，微生物菌群丰富度呈现降低趋势，并且T0组酸肉中Simpson指数低于发酵后的酸肉，表明发酵后的酸肉中微生物菌群多样性降低。

4.2

通过β多样性分析牛肉酸肉发酵过程中微生物菌群组成的差异性，其中NMDS分析是β多样性分析的一种方法，NMDS分析结果的优劣由Stress值检验，Stress在0.5～0.15之间表明NMDS二维图中的样本点具有代表性，图中用不同形状及颜色的点表示不同的样本，样本点之间的距离越远表明样本的物种组分差异越大。由图8可知，T0与T15、T30、T45的牛肉酸肉样品间的距离均较远，菌群结构差异较大。结合α多样性分析可知，此种差异可能来自发酵后微生物菌群丰富度的改变。

4.3 菌群组成分析

根据图9a所示，牛肉酸肉在发酵过程中微生物门水平细菌群落组成分析，共鉴出10 个相对丰度＞1%的门，分别为厚壁菌门（Firmicutes）、蓝菌门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteriota）、unclassified_k__norank_d__Bacteria、帕特西菌门（Patescibacteria）、蛭弧菌门（Bdellovibrionota）、梭杆菌门（Fusobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）。其中T0组酸肉样品中的优势菌门为蓝菌门、厚壁菌门，其次是变形菌门。有研究表明未发酵的牛肉中的核心菌群有厚壁菌门、蓝菌门、变形菌门、拟杆菌门，与本研究结果一致。随着牛肉发酵时间延长，厚壁菌门相对丰度升高，在T45时达到91.45%，成为发酵牛肉酸肉中主要优势菌门。这可能是因为发酵过程中酸度的变化，而厚壁门菌对环境变化具有较高的适应性，同时牛肉本身也含有丰富的厚壁门菌，相比于其他菌门，该类菌门的微生物能够更好地适应由发酵引起的底物和环境的变化，有利于成为优势菌门。在牛肉酸肉发酵过程中，菌落多样性明显减少，发酵的微生物生态结构也由最初的多种菌门共存演变到以厚壁门菌为主导的单一发酵模式，这与Chen Xi等的研究结果一致。

如图9b所示，牛肉酸肉在发酵过程中微生物属水平细菌群落组成分析，共鉴出10 个相对丰度＞1%的属，分别是乳酸杆菌属（Lactobacillus）、norank_f__norank_o__Chloroplast、葡萄球菌属（Staphylococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）、明串珠菌属（Leuconostoc）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、unclassified_p__Proteobacteria、norank_f__Mitochondria、假单胞菌属（Pseudomonas）、巨大球菌属（Macrococcus）。与T0组酸肉菌群组成相比，T15、T30、T45的样品中乳酸杆菌、魏斯氏菌属相对丰度显著升高，成为牛肉发酵过程中的优势菌属；而葡萄球菌属、产碱杆菌属、假单胞菌属、巨大球菌属在发酵过程中相对丰度降低。赵改名等对牛肉发酵香肠成熟过程中理化性质和微生物菌群变化进行研究，结果表明在牛肉发酵香肠中乳酸杆菌属、魏斯氏菌属在发酵后期同样成为优势菌属。

4.4 微生物群落组间差异分析

为了进一步确定在牛肉酸肉发酵过程中对细菌群落差异贡献最大的微生物特征，进行了线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe），在LEfSe图中，y轴表示不同的微生物群落特征，x轴表示LDA分数。每个特征用不同的颜色表示，并按照其富集程度和分类属于不同的分支体现出来。统计分析从门到属的水平进行，在LEfSe图中，可以通过条形图来确定不同组之间的相对丰度，颜色代表其富集程度。如图10所示，发现17 个具有显著差异性的物种，在属水平上有10 个显著差异性的物种。乳酸杆菌属、魏斯氏菌属在发酵后期阶段（T45）富集。

4.5 菌群组成和特征风味物质的相关性分析

Spearmen相关性分析一般用于对微生物菌群与风味物质间相关性进行初步分析，利用Spearmen相关系数分析了17 种特征风味物质与微生物属间的相互关系，结果如图11所示。乳酸杆菌属和葡萄球菌属与正己醇M、异丁醇M、正丁醇M、1-戊醇M、异戊醇M、正丁醛、丁酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪M、乙酸乙酯D、乙酸甲酯、2-丁醇、2-甲基丁酸乙酯、醋酸、2-庚醇、2,6-二甲基吡嗪D、3-甲基丁酸乙酯M，共16 种风味化合物呈现显著正相关（P＜0.05）。明串珠菌属与正己醇M、1-戊醇M、异戊醇M、2,6-二甲基吡嗪M、2-丁醇、2-甲基丁酸乙酯、醋酸、2-庚醇、2,6-二甲基吡嗪D、3-甲基丁酸乙酯M，共10 种风味化合物呈现正相关，这表明乳酸杆菌属、葡萄球菌属和明串珠菌属对酸肉特征风味物质的形成贡献较大。本研究从属的水平解析了牛肉酸肉中的微生物菌群组成，并基于属水平进一步明确了与特征风味物质相关的具体微生物。Yu Honghong等对马肉肠发酵过程中细菌群落演替及挥发性化合物变化的研究结果表明，乳酸杆菌属与丁酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯等化合物密切相关，该菌属相对丰度越大，丁酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯等化合物的含量越大；另外，Hu Yingying等的研究表明，葡萄球菌属与2-甲基丁酸乙酯的含量呈显著正相关；Xiao Muyan等的研究发现明串珠菌属与酯类化合物呈正相关，这与本研究结果趋势一致。Li Yuxin等在对接种乳酸菌和葡萄球菌混合发酵剂对发酵香肠细菌群落和挥发性风味的影响研究中发现，乳酸杆菌属在生长过程中能够将蛋白质和碳水化合物降解为酸和醇，从而导致pH值降低，抑制有害微生物的生长，发酵可以促进酸肉中乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-丁醇等香气物质的积累，提升酸肉整体风味。

5 结论

本研究结合电子鼻、电子舌、GC-IMS和16S rRNA技术探究牛肉酸肉发酵过程中的挥发性风味物质与微生物群落组成的相关性。结果表明：发酵过程中共检测到40 种挥发性化合物，主要包括醇类、醛类、酸类、酯类等，其中具有显著差异的挥发性化合物有正己醇、异丁醇、正丁醇等17 种。随着发酵时间的延长，丁酸甲酯、乙酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯M等酯类物质的含量显著上升，赋予酸肉特殊的风味。发酵前期酸肉中细菌多样性较高，随着发酵时间的延长，厚壁菌门占据绝对优势，成为发酵酸肉中的优势门。LEfSe分析发现17 个具有显著差异种属，乳酸杆菌属和魏斯氏菌属在发酵过程中逐渐取代葡萄球菌属、产碱杆菌属等成为发酵酸肉的优势菌属。相关性分析发现，乳酸杆菌属和葡萄球菌属的丰度与正己醇M、异丁醇M、正丁醇M、1-戊醇M、异戊醇M、正丁醛、丁酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪M、乙酸乙酯D、乙酸甲酯、2-丁醇、2-甲基丁酸乙酯、醋酸、2-庚醇、2,6-二甲基吡嗪D、3-甲基丁酸乙酯M的含量呈正相关。该研究结果可为牛肉酸肉风味品质提升和工业化生产工艺改进提供理论依据和数据支持。

作者简介

通信作者

朱成林，西南民族大学药学与食品学院副教授， 意大利博洛尼亚大学博士（国家公派），硕士研究生导师，泸州老窖博士后科研工作站博士后，主要致力于应用多组学技术探究发酵食品风味形成机制和药食同源食品对肠道菌群及其代谢产物调控机制研究。主持参与国家级、省部级科研项目10余项。以第一作者或通讯作者发表一区TOP论文8篇，二区14篇，任多本SCI期刊青年编委及审稿人。教学上，获省部级教学竞赛三等奖2项、校级教学竞赛特等奖2项，获评校青年教学标兵。同时，积极投身食品健康科普工作，获2020年全国科普讲解大赛优秀奖、四川省2024年科普讲解大赛一等奖、第四届国家民委系统科普讲解大赛一等奖，被授予四川省十佳优秀科普使者，成都市双流区首届空港科普大使。

第一作者

唐钰婷，西南民族大学药学与食品学院2024级研究生，研究方向为食品组学，本科期间参加第九届“挑战杯”广西大学生创业计划竞赛中荣获银奖；参加第六届中国国际互联网＋大学生创新创业大赛广西赛区荣获铜奖。

本文《 牛肉酸肉发酵过程中特征风味物质与微生物群落组成的相关性 》来源于《食品科学》2025年46卷第15期256-239页，作者： 唐钰婷，周秉德，杨智博，赵鑫，唐俊妮，胡滨，朱成林 。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250206-014 。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：安宏琳；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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