FSHW | 铁皮石斛多糖通过调节肠道菌群和减轻肠黏膜屏障损伤来减轻小鼠模型中的2型糖尿病

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Introduction

2型糖尿病（T2DM）是一种以血糖升高为特征的慢性代谢性疾病，由遗传因素、表观遗传修饰和环境因素等多种致病因素引起全身性低水平炎症、胰岛素分泌不足或功能障碍，导致糖、脂肪、蛋白质、水和电解质等代谢紊乱，影响机体的正常生理活动。近年来，随着生活水平的提高和生活方式的改变，T2DM的发病率逐年上升，已成为危害人们健康的严重公共卫生问题。大量研究表明，肠道菌群失调在T2DM的发生发展中起关键作用，可诱发慢性低水平炎症、胰岛素抵抗，进而引发异常的糖脂代谢。因此，通过生活方式干预（如饮食、运动等）、补充微生态制剂（益生菌、益生元和合生元等）、降糖药、微生物移植等方式靶向调节肠道菌群，成为防治T2DM的新策略。

肠道菌群不仅帮助宿主维持正常的消化、吸收和新陈代谢，还通过与肠黏膜相互作用来维持肠上皮细胞的功能稳态。由肠上皮细胞及其紧密连接组成的肠道机械屏障是抑制异位肠道细菌和脂多糖（LPS）渗漏的关键。LPS是肠道革兰氏阴性菌外膜的重要组成部分，也称为内毒素。当肠道通透性增加时，过多的内毒素会进入血液循环并引发炎症级联反应，破坏肠道屏障功能的稳态。最近的研究证实，肠道通透性增加和肠道来源的LPS易位是T2DM代谢炎症的重要原因。因此，靶向肠道屏障是治疗T2DM的一种很有前途的策略。多糖作为一种优质的益生元，能有效刺激肠道有益菌的增殖，抑制潜在有害菌的生长。特别是植物来源的天然多糖，具有安全、绿色和稳定的效果，在调节肠道菌群和保护肠道健康方面显示出巨大的优势。

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科多年生草本植物，广泛分布于东南亚和澳大利亚，已被证明具有降血糖、抗炎、促进肠道健康、抗衰老、抗氧化和抗肿瘤等多种生理作用。铁皮石斛除了在亚洲传统医学中具有药用外，还是我国无毒无害的新型食品资源，已被列入药食产品目录和食品新原料目录。铁皮果仁含有多种营养物质，包括多糖、菲化合物、生物碱、糖苷等。其中，铁皮石斛多糖（DOP）是功能成分含量最高的，已被确定为产生其有益作用的主要成分之一，尤其是对糖尿病的有益作用，但其降糖机制仍不清楚。

因此，本研究从抗炎和肠道微生物调节的角度出发，利用高脂饮食（HFD）和链脲佐菌素（STZ）诱导的T2DM模型小鼠研究DOP的降血糖作用并揭示其潜在机制。

图1 实验设计示意图

Results

DOP改善了T2DM小鼠的症状

在本研究中，使用HFD喂养和STZ注射建立了T2DM模型。如图1所示，与NC组相比，MC组小鼠的症状为进食和水消耗增加（P＜0.001）和体质量减轻（P＜0.001），而DOP干预显著改善了T2DM小鼠的多食（P＜0.01）、烦渴（P＜0.001）和体质量减轻（P＜0.05）症状。此外，MC组小鼠的FBG值（（23.75±4.11）mmol/L）远高于NC组（（6.02±0.77）mmol/L），DOP处理显著降低FBG水平（P＜0.01，图2A），但与NC组相比仍有差距。

图2 DOP缓解了葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗

DOP缓解葡萄糖耐量不良和胰岛素抵抗

为了阐明DOP在控制葡萄糖稳态和胰岛素敏感性中的作用，除了FBG水平外，还测量了GSP、OGTT和胰岛素水平。相对于MC组，DOP干预使T2DM小鼠的GSP值显著降低了25.66%，这意味着DOP可以有效抑制T2DM小鼠在过去1～3周内的血糖升高（图2B）。DOP处理组小鼠在个别时间点的口服葡萄糖耐量优于MC组，AUC在120 min内下降了35.04%（图2C-D），表明DOP可以增强机体调节升高血糖水平的能力。同样，与MC组相比，DOP干预后血清胰岛素水平也显著降低了7.63%（图2E），而HOMA-IR降低了42.59%（图2F），表明DOP可以部分逆转T2DM小鼠的葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗。

DOP调节血脂代谢

糖尿病作为一种慢性代谢性疾病，伴有脂质代谢紊乱，诱发高脂血症，表现为HDL-C明显降低，LDL-C、TC、TG显著升高。因此，本研究检验了DOP对T2DM小鼠血脂水平的影响。与MC组相比，DOP给药显著降低了TC、TG和LDL-C水平（图3A-C，P＜0.01），伴有HDL-C水平升高（P＜0.05），表明DOP可有效改善T2DM小鼠的高脂血症。

图3 DOP调节血脂代谢

DOP抑制T2DM小鼠血清代谢炎症水平

多项证据表明，T2DM常伴有肠黏膜损伤，这可能导致细菌及其衍生毒素通过血液循环进入人体质量要组织器官，诱发代谢炎症，进而进一步促进T2DM的发生和变化。因此，进一步检测了肠道通透性血清学指标LPS和血清炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平。结果显示，与NC组相比，MC组小鼠的LPS含量显著增加（图4A，P＜0.001），表明HFD喂养和STZ注射诱导的T2DM小鼠存在明显的肠道屏障损伤和LPS渗漏。然而，DOP处理逆转了上升趋势（P＜0.001）。此外，研究发现，DOP有效抑制血清促炎因子如TNF-α（P＜0.05）、IL-1β（P＜0.001）和IL-6（P＜0.001）的表达，但对抗炎IL-10的表达没有显著影响（图4B-E）。

图4 DOP抑制T2DM小鼠的血清炎症水平

T2DM小鼠血清LPS与糖脂代谢和炎症指标的相关性分析

为探讨血清LPS与糖脂代谢及炎症指标是否存在相关性，进行了Spearman相关性分析。结果显示，LPS与FBG、GSP、AUCOGTT、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、TNF-α、IL-6和IL-1β呈正相关，并与HDL-C呈负相关。综上所述，LPS与糖脂代谢和炎症因子水平显著相关，提示抑制LPS介导的炎症反应和保护肠黏膜完整性可能是DOP治疗T2DM的关键靶点。因此，在后续实验中，重点关注DOP对肠道黏膜屏障和肠道菌群的影响，并从肠道的角度研究DOP改善糖尿病的机制。

DOP抑制T2DM小鼠肠黏膜损伤血清标志物和肠道炎症因子的表达

为了研究DOP对肠黏膜屏障的影响，检查了与肠黏膜损伤相关的血清学标志物，包括DAO和D-LA，以及肠道炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10。数据显示，MC组小鼠血清中DAO和D-LA水平显著升高，提示T2DM小鼠存在肠道黏膜损伤，但DOP干预后两项指标分别显著降低17.34%和5.53%（图5A）。此外，如图5B-E所示，相对于MC组，补充DOP显著降低肠道TNF-α（P＜0.01）、IL-1β（P＜0.05）和IL-6（P＜0.01）水平，并促进IL-10水平（P＜0.05）。综上所述，上述结果表明，DOP通过抑制肠道炎症对T2DM小鼠肠道黏膜损伤具有良好的修复作用。

图5 DOP抑制T2DM小鼠肠黏膜损伤血清标志物和肠道炎症因子的表达

DOP抑制T2DM小鼠肠道氧化应激水平

肠上皮内氧化应激也被认为是导致肠黏膜损伤的重要因素，因此本研究进一步检测了实验小鼠结肠组织中的氧化应激相关指标。数据显示，T2DM小鼠肠道氧化应激严重，表现为SOD、CAT和GSH水平显著降低（P＜0.001），MDA水平显著升高（P＜0.001）。DOP干预后小鼠结肠氧化应激水平呈向NC组的趋势，其中SOD、CAT和GSH水平分别显著升高41.79%、29.79%和24.26%，而MDA水平显著降低29.54%（图6），表明DOP减轻了T2DM小鼠结肠的氧化应激损伤。综上所述，DOP通过抑制肠道炎症和氧化应激水平在肠道屏障中发挥保护作用。此外，必须强调的是，相关性分析表明，DOP对肠道LPS泄漏的抑制在降低肠道炎症因子和氧化应激的升高中起关键作用。

图6 DOP抑制T2DM小鼠的肠道氧化应激水平

DOP调节T2DM小鼠紧连接蛋白的表达

研究证实，在HFD和STZ诱导的T2DM小鼠模型和自发性T2DM小鼠模型中均观察到异常紧密连接蛋白表达的表型特征，RT-qPCR检测显示，T2DM小鼠代表性肠道紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA表达显著降低（P＜0.001）。相比之下，DOP处理后ZO-1、Occluding和Claudin-1的mRNA表达水平呈上升趋势，分别增加了28.45%、38.34%和26.99%（图7A），表明DOP具有很强的调节肠道紧密连接蛋白表达的能力。

图7 （A）DOP对T2DM小鼠肠道紧密连接蛋白mRNA表达的影响；（B）结肠长度；（C）结肠解剖组织的代表性图片；（D）结肠组织的H&E染色

DOP减轻T2DM小鼠的肠道组织病理学损伤

如图7B-C所示，MC组小鼠的结肠长度显著短于NC组（P＜0.01）。此外，DOP给药减弱了T2DM小鼠结肠缩短的影响，与MC小鼠相比，结肠长度增加了29.54%。为了探索T2DM小鼠的肠道病理变化和DOP的肠道保护作用，继续观察结肠组织的H&E染色图像（图7D）。结果显示，MC组小鼠表现为肠腺萎缩、隐窝结构变形，上皮细胞有一定程度的变性甚至坏死，伴有炎性细胞浸润和透射性增强。DOP干预后，上述病理变化得到不同程度的缓解。总之，DOP通过抑制肠道炎症和改善氧化应激，对肠道屏障发挥了良好的修复和保护作用，表明肠道屏障对DOP的保护作用可能是治疗T2DM的基础。

细菌群落组成分析

16S rRNA基因扩增子测序检测T2DM小鼠的粪便细菌群落。应用α-多样性指数，包括Chao1、Observed、Simpson和Shannon，以评估细菌的丰富度和多样性。其中，Chao1和Observed物种指数证明了细菌的丰度，而Shannon和Simpson指数反映了群落多样性。如图8所示，MC组的细菌丰富度和多样性与NC组相比显著增加，而DOP干预后，细菌的丰富度显著降低约30%（P＜0.001），群落多样性也大幅下降并趋向于NC组，表现为DOP对T2DM小鼠肠道菌群有显著影响。

图8 DOP对T2DM小鼠粪便细菌群落α-多样性的影响

在门水平上，厚壁菌门、放线菌门和变形菌门是所有实验组中检测到的优势门（图9A-B），它们的相对丰度占细菌群落总数的90%以上。与NC组相比，MC组肠道细菌的变形菌门相对丰度增加了750.09%，厚壁菌门和放线菌门的相对丰度分别降低了16.98%和42.49%。然而，DOP处理可以恢复上述门水平。值得注意的是，堆积圆圈中的分类树和分层聚类分析进一步表明，DOP对HFD和STZ诱导的T2DM小鼠的细菌群落组成具有调节作用（图9C-D）。

图9 DOP对T2DM小鼠肠道微生物群组成和丰度的影响

总体而言，在属水平上，NC组小鼠中Allobaculum、Bifidobacterium和Lactobacillus的丰度是压倒性的，高达84.07%。其中，与NC组相比，T2DM小鼠肠道菌群表现出明显的变化，双歧杆菌属和乳酸菌属的丰度降低；以及Helicobacter、Bacteroides、Desulfovibrio、Odoribacter、Enterococcus、Flexispira、Adlercreutzia、Parabacteroides、Anaeroplasma、AF12、Akkermansia和Halomonas的增加（图9E-F）。相反，这些属在DOP处理后得到恢复，特别是双歧杆菌属和乳酸杆菌属的相对丰度分别增加了139%和8%，而Helicobacter、Desulfovibrio和Enterococcus的相对丰度分别降低了95%、9%和73%。

关键细菌属分析

已经证明DOP可以调节T2DM小鼠的肠道菌群，对双歧杆菌和乳酸杆菌有显著的富集作用，但对Helicobacter、Desulfovibrio和Enterococcus有抑制作用。为进一步探讨肠道菌群变异与T2DM相关指标之间的潜在关系，基于Spearman相关性分析计算本研究获得的5个主要属与肠道炎症和糖脂代谢相关指标之间的相关性。如图10所示，DOP组减少的属（Helicobacter、Desulfovibrio和Enterococcus）与血清LPS和肠道促炎细胞因子呈正相关，而DOP组丰富的属（双歧杆菌和乳酸菌）与肠道炎症状态呈负相关，表明DOP显著减轻了糖尿病患者的内毒素血症和肠道炎症小鼠通过重塑肠道微生物群结构。同样，5个主要属与糖脂代谢指标的相关性分析表明，DOP组中减少的细菌Helicobacter、Desulfovibrio和Enterococcus可促进T2DM的发病机制，DOP组中丰富的双歧杆菌和乳酸菌可以阻断T2DM的发病机制。总的来说，上述结果表明，DOP 可以通过调节特定肠道微生物的丰度和组成来改善肠道炎症和黏膜屏障功能，表现为有益菌双歧杆菌和乳酸菌的丰度增加，有害菌Helicobacter、Desulfovibrio和Enterococcus的产生减少在T2DM小鼠的粪便中，从而缓解T2DM小鼠的症状。

图10 T2DM相关参数与属水平肠道微生物群相对丰度的相关性分析

Conclusion

这项研究表明，DOP减轻了HFD和STZ诱导的T2DM小鼠的体质量减轻，改善了葡萄糖耐量缺陷和胰岛素抵抗，调节了脂质代谢，并对LPS释放和代谢炎症有改善作用。然后，相关性分析显示，DOP对肠道通透性的缓解作用是降低炎症因子升高和糖脂代谢紊乱的关键。此外，DOP可以通过抑制肠道炎症和氧化应激水平以及促进肠道紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）的基因表达来保护肠道屏障。16S rRNA分析表明，DOP的上述有益作用是通过重塑肠道菌群来实现的，包括抑制潜在的肠道病原体Helicobacter、Desulfovibrio和Enterococcus，以及恢复双歧杆菌和乳酸菌的有益细菌，Spearman相关性分析进一步证实了这一点。总之，DOP补充剂直接影响肠道黏膜屏障的完整性，最终改善T2DM小鼠的代谢参数，很可能是通过其卓越的抗炎和肠道微生物群调节作用。这些结果为DOP作为糖尿病食品和药物应用中的潜在益生元提供了理论依据。

Dendrobium officinale polysaccharide attenuates type 2 diabetes in mice model by modulating gut microbiota and alleviating intestinal mucosal barrier damage

Xiaoxia Chena, Chun Chena,b,c,d,*, Changyang Mae, Wenyi Kange, Junlin Wuf,*, Xiong Fua,b,c,d

a Guangdong Province Key Laboratory for Green Processing of Natural Products and Product Safety, Guangzhou 510640, China

b SCUT-Zhuhai Institute of Modern Industrial Innovation, School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China

c Guangzhou Institute of Modern Industrial Technology, Guangzhou 511458, China

d Overseas Expertise Introduction Center for Discipline Innovation of Food Nutrition and Human Health (111 Center), Guangzhou 510640, China

e National R&D Center for Edible Fungus Processing Technology, Henan University, Kaifeng 475004, China

f Guangzhou Wondfo Health Science and Technology Co., Ltd., Guangzhou 510640, China

*Corresponding author.

Abstract

The purpose of this study was to investigate the hypoglycemic effect and mechanism of Dendrobium officinale polysaccharide (DOP) on type 2 diabetes mellitus (T2DM) mice established by high-fat diet and streptozotocin. The results showed that DOP improved glycolipid metabolism and serum inflammation levels, and inhibited intestinal-derived lipopolysaccharide (LPS) translocation, suggesting that inhibiting LPS-mediated intestinal barrier damage may be a key target for DOP to alleviate T2DM. Interestingly, the study found that DOP reduced intestinal inflammation and oxidative stress levels, significantly up-regulated the mRNA expression of tight junction proteins Claudin-1, Occludin and zonula occluden-1 (ZO-1), and ameliorated intestinal epithelial damage. In addition, DOP strongly inhibited the intestinal pathogenic bacteria and LPS-producing bacteria Helicobacter, Enterococcus and Desulfovibrio with a reduction rate of 95%, 73% and 9%, respectively, and promoted the proliferation of anti-inflammatory bacteria Bifidobacterium and Lactobacillus by 139% and 8%, respectively. Taken together, the hypoglycemic effect of DOP was related to the protection of intestinal mucosal barrier, and its underlying mechanism lied in its excellent anti-inflammatory and gut microbiota-modulatory effects, providing a theoretical basis for developing DOP as a novel prebiotic in functional food for diabetes.

Reference:

CHEN X X, CHEN C, MA C Y, et al.

Dendrobium officinale

翻译： 田雨欣（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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