《食品科学》：湘潭大学谭小丽副教授等：蓝莓采后致病菌的分离鉴定及精油防控

蓝莓（

Vaccinium corymbosum

基于此，湘潭大学化工学院的万春秀、张楚萱、谭小丽*等首先从自然发病的蓝莓果实分离引起蓝莓腐烂的优势致病菌，通过形态学和分子生物学鉴定其种类，并进一步探究25 种天然植物精油对蓝莓致病菌的作用效果，以期为开发针对性的蓝莓保鲜技术提供理论参考。

1 病原菌菌落形态学观察与鉴定

经过纯化后的蓝莓病原菌离体以及活体形态如图1所示，共分离出4 种形态的病原菌，分别命名为I、II、III、IV。病原菌I菌丝为白色，分生孢子梗为典型的扫帚状，且彼此紧贴。孢子为暗绿色，呈圆形或椭圆形，直径为3 μm左右，分生孢子成熟后极易脱落。在PDA培养基上产孢量高，正面质地为绒毛状，有时生长状态呈放射状，颜色为青绿色或者深绿色，背面产黄褐色色素。侵染蓝莓后白色菌丝在伤口软腐处蔓延并伴随大量青色孢子产生，根据其形态特征与青霉属特征相似度极高，推测病原菌I为青霉属真菌。

病原菌II菌丝为白色，壁厚且光滑，顶部形成球形顶囊，顶囊上覆盖一层梗基和小梗，分生孢子由小梗上产出。分生孢子为黑褐色，呈圆形或近圆形，直径为4 μm左右。在PDA培养基上最先蔓延的是一层微乳白的分泌物，产孢量高，正面质地为绒状，颜色为黑褐色或者棕褐色，背面白色或微黄。侵染蓝莓后蓝莓果肉软腐，有黑色霉层覆盖并伴随汁液流出，根据其形态特征与曲霉属中的黑曲霉相似，推测病原菌II为曲霉属真菌。

病原菌III菌丝为褐色，有隔膜。分生孢子为棕褐色梭形或倒棒形，具有横隔或者纵膈，形成壁砖状结构。在PDA培养基上产孢量低，正面为褐绿色或深绿色絮状，背面为褐色或黑褐色。侵染蓝莓后伤口处有灰绿色霉层覆盖，偶尔伴随无色汁水流出，根据其形态特征与链格孢属相似度高，推测病原菌III为链格孢属真菌。

病原菌IV菌丝为白色，呈絮状或者丛卷毛状，纤细且密集。分生孢子为浅粉色，呈棒形。在PDA培养基上正面最先蔓延的是膜状物，膜上附着着菌丝，部分中期正面为粉色，背面为橘红色，后期正面会变成浅紫色，背面为深紫色。侵染蓝莓后伤口处附着白色絮状菌丝并伴随粉色孢子产生。

2 病原菌的致病力分析

将纯化过的菌株制备菌悬液并回接至蓝莓果实上，放入培养箱中培养3～5 d。如图2所示，病原菌I侵染的蓝莓果实在第2天伤口及周围发生软腐，偶有凹陷，能明显观察到菌丝蔓延，果实出现青绿色霉层，发病猛烈，在侵染第2天时发病率就达到了100%。病原菌II侵染的蓝莓果实在第2天整果内部逐渐软腐，伴随红色汁水流出以及菌丝蔓延，果实伤口出现黑褐色霉层，发病猛烈，在侵染第3天时发病率达到100%。病原菌III侵染的蓝莓果实在第3天伤口周围开始出现凹陷，伴随无色汁水流出，菌丝蔓延速度稍慢，果实伤口出现灰绿色霉层，在侵染第3天发病率达到100%。病原菌IV侵染的蓝莓果实，菌丝大多数在伤口处生长，病斑为白色絮状，伤口不发生明显扩张，虽然在侵染第3天时发病率也达到了100%，但致病症状较前3 种菌轻。综合致病力实验结果，4 种致病菌的致病力排序为病原菌I＞病原菌II＞病原菌III＞病原菌IV。

3 系统发育树构建

利用ITS、BenA和CaM基因进一步对4 种致病菌进行分子生物学鉴定，结果如图3所示。病原菌I、II分别与皮落青霉（Penicillium crustosum）、塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）进化关系最近，病原菌III的ITS与链格孢菌（Alternaria alternata）的ITS序列同源性最高，生长状态也符合形态学上对链格孢菌的描述，病原菌IV的BenA序列与串珠镰刀菌（Fusarium verticillioides）的BenA序列同源性最高。结合形态学分析，确定分离出来的病原菌I为皮落青霉，病原菌II为塔宾曲霉，病原菌III为链格孢菌，病原菌IV为串珠镰刀菌。考虑到病原菌IV的致病力较弱，因此后续部分实验只针对蓝莓优势致病病原菌I、II和III展开。

4 病原菌生长条件分析

4.1 最适生长温度

如图4所示，在4 ℃条件培养时病原菌II完全不长，病原菌I和III仍能保持缓慢生长。随着培养温度的升高，3 种菌的生长速度均增加，其中病原菌I和III的生长速度在25 ℃时达到最高，温度继续增加则生长速度降低，且温度越高抑制效果越明显，最适温度在25 ℃左右。在4～28 ℃范围，病原菌II的生长速度随培养温度升高持续增加，之后温度再增加，病原菌仍保持较快的生长速度，表现出较好的温度耐受性，最适生长温度在28 ℃左右。

4.2 生长曲线

采用非线性拟合的方法能够更清晰地了解到病原菌I、II和III的生长情况，结果如图5所示。6～48 h和48～72 h分别是病原菌I的生长对数期和生长稳定期；12～36 h和36～72 h分别是病原菌II的生长对数期和生长稳定期；0～36、36～66 h和66～72 h分别是病原菌III的生长调整期、生长对数期和生长稳定期。

4.3 孢子萌发率

如图6所示，3 种病原菌在培养6 h时均已萌发，其中病原菌I的孢子萌发率最高（33%），病原菌II次之（19.67%），病原菌III最低（15.59%）。随着培养时间的延长，3 种病原菌的孢子萌发率持续增加，且均在12 h完全萌发。

5 植物精油体外抑菌效果分析

5.1 25 种植物精油的作用效果

由于验证的植物精油种类较多，以致病力最强的病原菌I（皮落青霉）为研究对象，筛选作用效果较好的植物精油。如表1所示，在25 种植物精油中，浓度为2 μL/mL的芥末精油、牡荆精油、花椒精油、茉莉精油、依兰精油、细辛精油、艾草精油、续断精油、丁香罗勒精油、红景天精油能完全抑制病原菌I的生长，山苍子精油对病原菌I的抑菌浓度为1.5 μL/mL，艾草精油和快乐鼠尾草精油对病原菌I的抑菌浓度为2 μL/mL，其他精油对病原菌I的抑菌浓度均高于2 μL/mL。

选取抑菌浓度小于2 μL/mL的植物精油对病原菌II（塔宾曲霉）进行作用效果检测，发现芥末精油、丁香罗勒精油对病原菌II的抑菌浓度均为1 μL/mL，茉莉精油、续断精油、山苍子精油、红景天精油对病原菌II的抑菌浓度均为2 μL/mL（表2）。

5.2 精油的有效抑菌浓度分析

根据96 孔板初筛出的精油种类、作用浓度（≤2 μL/mL）以及剔除不易被人接受的芥末精油，最终筛选出茉莉精油、丁香罗勒精油、续断精油、山苍子精油和红景天精油5 种精油进行平板验证实验。如图7所示，2 μL/mL的茉莉精油、丁香精油、山苍子精油和红景天精油能完全抑制病原菌I、II、III和IV的生长，2 μL/mL的续断精油可完全抑制病原菌I、II和III的生长，对IV的抑菌率为97%。这5 种精油对4 种病原菌均具有高效的体外抑菌效果。

进一步测定了5 种植物精油对4 种病原菌的MIC和MFC，结果如表3所示。5 种精油对病原菌I的MIC以及MFC为丁香罗勒精油＝山苍子精油＜茉莉精油＝续断精油＝红景天精油；对病原菌II的MIC以及MFC为山苍子精油＜丁香罗勒精油＜茉莉精油＝续断精油＝红景天精油；对病原菌III的MIC以及MFC为山苍子精油＜丁香罗勒精油＜茉莉精油＝红景天精油＜续断精油；对病原菌IV的MIC以及MFC为山苍子精油＜茉莉精油＝丁香罗勒精油＜红景天精油＜续断精油。5 种精油对4 种菌的MIC范围在0.5～2 μL/mL，MFC范围在1～4 μL/mL，且每种精油对每种菌的MFC/MIC均不超过2 倍。山苍子精油和丁香罗勒精油对病原菌I、II、III皆表现出较好的抑菌效果，MIC均不超过1 μL/mL，MFC均不超过2 μL/mL。

6 5 种植物精油对接种皮落青霉的蓝莓果实病害发生的影响

如图8所示，对照组蓝莓果实在接种皮落青霉的第2天，伤口出现明显病斑和霉层，随着贮藏时间的延长，病斑逐渐扩大。在第6天时，果实发病率为100%，病斑布满蓝莓果实，果实发生严重腐烂。相比对照组，茉莉精油和山苍子精油处理组的蓝莓果实青霉病在贮藏期间得到了较好的控制，在贮藏结束时果实发病情况和表面的霉层仍然较少。在贮藏第6天，茉莉精油、丁香罗勒精油、续断精油、山苍子精油和红景天精油处理组的发病率分别为72.5%、100%、97.5%、15%和97.5%，丁香罗勒精油、续断精油和红景天精油在蓝莓果实上没有表现出明显的病害控制效果。山苍子精油和茉莉精油熏蒸对蓝莓青霉病发生有较好的控制作用，其中山苍子精油的作用效果最佳，茉莉精油次之。

7 讨论与结论

蓝莓果实脆嫩多汁、营养丰富，采后易遭受病原菌侵染而大量腐烂。为降低蓝莓采后的经济损失，通过分离、鉴定引起蓝莓腐烂的优势病原菌并对其进行控制。形态学和分子测序是鉴定病原菌种类的常用方法，依据4 种菌株在PDA上生长的菌落特征、显微镜下的分生孢子梗和分生孢子的形态特征对其进行初步鉴定，初步判定病原菌I、II、III和IV分别为青霉（Penicillium spp.）、曲霉（Aspergillus spp.）、链格孢霉（Alternaria Nees）和镰刀菌（Fusarium spp.）。致病性分析发现4 种菌的致病力排序为I＞II＞III＞IV。形态学鉴定不能很好地区分同属的病原菌种类，而保守基因测序可进一步将病原菌区分。Žebeljan等通过ITS、BenA、CaM和RPB2基因鉴定出了梨果中的致病菌为皮落青霉；Zhang Yusen、Choi和张婷等根据ITS、BenA、CaM测序差异对土壤以及稻谷中的曲霉分离株进行了新分类物种鉴定，并且从稻谷中分离鉴定出了塔宾曲霉。Gannibal和Fulcher等验证了链格孢菌在目前的分子技术中物种界定并不明确，统称为链格孢菌。在本研究中，根据形态学特征和3 种基因（ITS、BenA和CaM）的测序，分离获得的4 种致病菌分别为皮落青霉、塔宾曲霉、链格孢菌和串珠镰刀菌。罗冬兰等在贵州粉蓝蓝莓中分离到了链格孢菌、灰葡萄孢菌以及胶孢炭疽等，且主要致腐菌为胶孢炭疽。刘春燕等在四川蓝莓中分离鉴定出了黑曲霉、青霉、噬木枝状枝孢菌、类拟盘多毛孢菌和链格孢菌5 种优势致病菌。周倩等在辽宁蓝莓中分离鉴定出了青霉、产黄青霉和链格孢菌3 种优势致病菌。由此看出，不同地区蓝莓上的优势病原菌略有差异，可能是因为各地区气候、地质以及蓝莓品种不同导致。为了更好地了解优势病原菌的生长特性，测定了它们的生长最适温度、生长曲线以及孢子萌发情况，发现病原菌皮落青霉和链格孢菌对低温的耐受性较好，在4 ℃条件下仍能生长，它们的最适生长温度为25 ℃左右，与Camardo和范文忠等测定的最适生长温度结果一致。塔宾曲霉对低温耐受性较差，但对高温耐受性较好，最适温度在28 ℃左右，与陈江研究的塔宾曲霉生长状态一致。因此，针对皮落青霉和塔宾曲霉引起的蓝莓病害，采取低温保鲜的效果可能较差，建议低温结合药物抑菌处理；而塔宾曲霉的防控可采取低温贮藏防控，温度较高会加速病害的发生。3 种菌的快速生长期均在2～3 d，孢子在培养12 h均能完全萌发。因此，果实在采摘后应尽早进行抑菌处理控制病原菌的生长进程。

植物精油具有易挥发、纯天然、广谱性抑菌以及低毒或无毒的天然优势，被广泛用于采后果蔬的防腐保鲜。Ceylan等通过测定番茄果实的品质以及营养物质含量，发现一定剂量的鼠尾草精油能够有效保持“Sentino F1”番茄冷藏期间的果实品质。王轶楠探究了山苍子精油对辣椒疫霉病的防治效果，2 mg/mL山苍子精油对辣椒疫霉的相对防治效果达到了68%。本实验探究了包括丁香罗勒精油、茉莉精油、山苍子精油和快乐鼠尾草精油等25 种天然植物精油对蓝莓致病菌的作用效果，发现茉莉精油、丁香罗勒精油、续断精油、山苍子精油和红景天精油在体外对蓝莓果实4 种致病菌的生长具有高效的抑制作用，且其作用浓度均不高于2 μL/mL。Rath等发现茉莉精油在31.25 μL/mL时才能完全抑制大肠杆菌的生长，与本研究结果不同。有研究表明，10 μL丁香罗勒精油在48 h时的抑菌圈直径大于40 mm，对青霉、链格孢菌、灰霉以及根霉均具有较强的抑制作用。续断精油对黄曲霉有较好的抑制效果，在800 mg/L时对黄曲霉菌的抑菌率为10.96%。红景天精油高于0.625 μL/mL对黑曲霉具有较好抑制作用。进一步检测茉莉精油、丁香罗勒精油、续断精油、山苍子精油和红景天精油对皮落青霉、塔宾曲霉、链格孢菌和病原菌IV的抑菌MIC和MFC，发现山苍子精油和丁香罗勒精油的作用效果最佳，MIC和MFC更小，基本上低于1 μL/mL。类似地，孙畅、黄晓霞和Li Yanjun等发现山苍子精油对意大利青霉菌和黄曲霉的MIC分别为1.17、0.80 μL/mL，对黄曲霉的MFC为1.50 μL/mL，能有效抑制柑橘病斑直径的扩散。丁香罗勒精油对香蕉炭疽的MIC和MFC分别为275 μL/L和600 μL/L。这些结果表明，茉莉精油、丁香罗勒精油、续断精油、山苍子精油和红景天精油具有广谱的抑菌作用，但其作用浓度在不同物种病原菌上存在差异。因此，进一步探究了这5 种精油在控制蓝莓病害发生中的作用，与5 种精油体外高效的抑菌作用不同，苍子精油熏蒸处理对蓝莓果实的青霉病具有最佳的控制效果，在贮藏第6天时果实发病率仅为15%，其次为茉莉精油处理（发病率比对照组低27.5%），续断精油和红景天精油仅对蓝莓青霉病具有微弱的控制效果（与对照无显著差异），而丁香罗勒精油完全没有表现出病害控制效果。体内和体外实验作用效果的差异可能受多种因素的影响，如处理方式、使用浓度、精油的稳定性和穿透性等的影响。在活体实验中，熏蒸方式可能会影响精油的分布和接触病原菌的机会，从而影响抑菌效果。另外，本实验仅使用MFC进行活体实验，该浓度可能不是丁香罗勒精油、茉莉精油、续断精油和红景天精油的最佳作用浓度。此外，丁香罗勒精油、续断精油和红景天精油在体外实验中表现出较高的抑菌活性，但在体内实验中，精油的稳定性和穿透性可能会受到果实表皮等生物屏障的影响，从而影响其抑菌效果。因此，精油在应用过程中应综合考虑各种影响因素。尽管如此，本研究证实山苍子精油和茉莉精油处理对蓝莓致病菌具有较好的控制体外和体内控制作用，可用于控制采后蓝莓腐烂损失。

本文《 蓝莓采后致病菌的分离鉴定及精油防控 》来源于《食品科学》2025年46卷第9期275-284页，作者： 万春秀，张楚萱，谢子涵，康晨睿，陶能国，谭小丽 。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20241012-066 。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：安宏琳；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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