读博五年成质粒大师，一周 100 个，无酶切多片段组装，真快

绝不绝，导师又安排我带着师妹构质粒，上周刚构完 100 个！

大师兄

博士延毕中

好家伙，你这成实验室质粒大师了啊！

沉迷构质粒

你这效率咋提上来的？我最近做的 3 片段组装总翻车，时间、经费都在燃烧，导师脸都绿了。

我用的无缝克隆预混液。片段丢进预混液，15 分钟温育直接完成组装，关键是不用找酶切位点，组装效率贼高！最近有免费试用，你们都试试

大师兄

还在为酶切位点匹配熬大夜？多片段组装总失败？NEB 最新推出快易无缝克隆预混液，15 分钟搞定载体构建，正好赶上 NEB 开学季超值促销：限时买 1 送 1，单次反应低至 ¥9.9（联系 NEB 一级代理商，可享优惠）。学霸君还给大家争取到试用福利，现在扫码 0 元领试用装，限量 50 份，千万不要错过哦！

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无缝克隆预混液到底什么原理？

NEB 快易无缝克隆预混液基于Gibson 组装原理开发，是一种高效、精准的体外 DNA 重组方法。该技术的核心在于利用多种酶的高度协同作用，在单次等温反应中实现多个线性 DNA 片段的无缝拼接。其具体机制可分为三步：

①核酸外切酶从 DNA 片段的 5' 端进行切割，产生的单链突出末端（overhang）通过碱基互补配对相互结合，形成带有间隙（gap）的 DNA

②DNA 聚合酶借助 DNA 合成过程填补上述间隙，形成仅含一个切刻（nick）的 DNA

③DNA 连接酶通过催化磷酸二酯键的形成修复切刻，最终得到完整的双链 DNA，即质粒。

简而言之，NEB 快易无缝克隆预混液不需要特定酶切位点，直接在 DNA 片段末端加「魔术贴」（重叠序列），可突破 DNA 片段长度及末端序列，实现多片段高效组装。

预混液使用 Tips

1. PCR 引物设计和组装片段加样量：

强烈建议使用我们的在线工具NEBuilder® Assembly Tool来设计 PCR 引物，使其在相邻 DNA 片段之间具有重叠序列，以将其组装到克隆载体。如进行多片段组装，建议使用NEBuilder® Protocol Calculator计算模板加样量，提高装效率。

2. 高效组装技巧：

为确保成功组装以及后续成功转化组装的 DNA，NEB 建议遵循以下做法：

DNA：如果快易无缝克隆反应液中所有 PCR 产物的总体积不超过快易无缝克隆反应体积的 20%，无需进行 PCR 产物纯化。在组装三个或更多 PCR 片段时，或组装长度超过 5 kb 的片段时，强烈建议进行 PCR 产物柱纯化。用于组装的纯化 DNA 可溶于 ddH2O（推荐使用 Mii-Q® 水或同等纯度的水）、TE 或其它稀释缓冲液。

插入片段：直接将片段组装到克降载体中时，组装片段的浓度应比载体浓度高至少 2～3 倍。组装三个或更多片段时，建议使用等摩尔比的片段。

生物学特性：一些 DNA 结构，包括反向重复序列和串联重复序列，会被大肠杆菌选择性丢失。大肠杆菌无法耐受某些重组蛋白，因此可能会导致转化效率较低或菌落较小。

感受态细胞：推荐使用高效化学感受态细胞，如 NEB® 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级，NEB ）。如果组装产物大于 10 kb，NEB 推荐使用 NEB 10-beta E. coli 感受态细胞（或 NEB 10-beta E. coli 电转感受态细胞）。反应产物可以直接加入细胞中，无需稀释，尽管进一步稀释反应混合物可能会提高转化效率。然而，当使用其他供应商的高效化学感受态细胞时，如果没有得到任何菌落，我们建议在转化前将反应混合物稀释 4倍。如果使用包括 NEB 在内的高效电转感受态细胞进行转化试验，我们建议将反应混合物稀释 3 倍。

电转化：电转化可以将转化效率提高几个数量级。将快易无缝克隆预混液产品用于电转化时，需要将反应液稀释 3 倍，并取 1μl 用于转化。

常见问题解答

FAQ：使用这种组装方法可以采用的重叠序列最短和最长长度是多少？

最短长度：已经证明，对于只有 12 bp 重叠末端的 DNA 片段也可以进行有效的组装。然而，这取决于重叠区域的 GC 含量。我们建议在对双链 DNA 进行组装时使用 15 bp 或更长的重叠序列且 Tm ≥ 48 °C（A-T pair = 2 °C，G-C pair = 4 °C）。

最长长度：快易无缝克隆预混液中的外切酶含量已经进行了优化，因此可以组装那些包含不超过 100-bp 重叠区域的 DNA 分子。

FAQ：可以 PCR 扩增组装的产物吗？

组装好的 DNA 分子是共价连接的，可以进行 PCR 扩增。此外，如果最终产物是闭合的环状 DNA 分子，它可以用作滚环扩增（RCA）的模板。

FAQ：使用快易无缝克隆预混液组装的 DNA 构建体适合用哪种类型的感受态细胞进行转化？

使用快易无缝克隆预混液组装得到的 DNA 构建体与大多数大肠杆菌感受态细胞兼容。NEB 推荐使用 NEB® 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级，NEB ）。如果组装产物大于 10 kb，NEB 推荐使用 NEB 10-beta E. coli 感受态细胞（高效级，NEB ）或 NEB 10-beta E. coli 电转感受态细胞（NEB ）。

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NEB 快易无缝克隆预混液核心优势

超快速度：15 分钟完成 2～3 个片段无缝克隆，快速呈现实验结果。

零纯化步骤：省去繁琐纯化流程，降低操作失误风险，节省试剂成本。

大片段兼容：支持长达 20 kb 的片段组装，满足多样实验需求。

灵活设计：自由定制序列，不依赖限制性酶切位点，实验设计更灵活。

广泛适用：适用于质粒构建、基因合成、定点突变等多种实验场景。

高性价比：20μl 反应体系，促销期间低至 9.9，减小体系更划算！

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内容策划：王丹琦

内容审核：吴军

题图来源：图虫创意

文中图片来源：NEB 官网截图